開口箭種質(zhì)資源及其混偽品的SSR指紋圖譜研究

陳 征， 周天華

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西漢中朱鹮國家級自然保護區(qū)， 陜西 洋縣 723301)

開口箭種質(zhì)資源及其混偽品的SSR指紋圖譜研究

陳 征1,2， 周天華1

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西漢中朱鹮國家級自然保護區(qū)， 陜西 洋縣 723301)

利用SSR分子標記技術研究開口箭種質(zhì)資源的DNA鑒定方法，構建其指紋圖譜，為開口箭及其混偽品鑒定提供參考依據(jù)。應用7對多態(tài)性豐富的SSR引物對10份開口箭種質(zhì)資源和5份混偽品進行了PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。結果表明，開口箭種質(zhì)資源及其混偽品的遺傳多樣性豐富，7對SSR引物共檢測出21個多態(tài)性位點，平均每對引物的多態(tài)性位點數(shù)為3.0；基于SSR分子標記的DNA指紋圖譜可將開口箭種質(zhì)及其混偽品完全區(qū)分開。該研究建立的SSR指紋圖譜可用于開口箭種質(zhì)資源標準化分析及市場化檢測。

開口箭； SSR標記； 指紋圖譜； 種質(zhì)資源； 混偽品鑒定

開口箭(TupistrachinensisBaker)，又名牛尾七、巖七、竹根七，為百合科開口箭屬多年生草本植物，主要分布于陜西(秦嶺以南)、四川、湖北等地，生于海拔1200～2200 m的林下、溪邊、路旁或灌木叢中潮濕處[1]。其根狀莖可入藥，味苦、辛，性寒，有毒，具有清熱解毒、散瘀止痛、祛風除濕等功效[2]。開口箭含有甾體皂苷、甾體皂甙元等有效化學成分，是秦巴山區(qū)常見的中藥材資源[3]。

不同產(chǎn)地的開口箭生長環(huán)境不同，其藥材質(zhì)量存在顯著差異。此外，開口箭的近緣種彎蕊開口箭(T.wattiiHook)、劍葉開口箭(T.ensifoliaWang & Tang)、筒花開口箭(T.delavayiFranchet)在形態(tài)特征上與其極為相似，常作為偽品與開口箭混淆。如開口箭的近緣種彎蕊開口箭(T.wattii)，僅在花序下部苞片的長短上與開口箭有差異[4]。因此該藥材在種植和采收上較為混亂，造成藥材品質(zhì)良莠不齊。鑒于不同物種及不同品種藥材的有效成分普遍存在差異，有必要開發(fā)出適合開口箭屬植物種質(zhì)鑒定的分子生物學方法，為開口箭屬植物進行藥材鑒定提供強有力的保障。

近年發(fā)展起來的DNA指紋圖譜技術在近緣種鑒定方面顯示出了明顯的優(yōu)勢[5]。簡單重復序列(Simple Sequence Rrepeat，SSR)又稱微衛(wèi)星DNA，是近幾年在PCR基礎上發(fā)展起來的DNA分子標記技術[6]。SSR標記具有結果可靠，重復性好，多態(tài)性豐富，操作簡單，呈共顯性遺傳等特點。與以往的分子標記相比，由于微衛(wèi)星DNA廣泛存在于真核生物基因組內(nèi)，且有以孟德爾方式分離、選擇中性、呈共顯性等優(yōu)點，因此SSR技術已成為研究種質(zhì)資源遺傳多樣性、基因組作圖、農(nóng)作物品種指紋圖譜的研究等工作的首選標記[7-8]。利用SSR指紋圖譜技術鑒定是在傳統(tǒng)形態(tài)分類學和物種準確鑒定研究基礎上的一大改革，該方法還不受環(huán)境因素的影響、不受樣本形態(tài)和材料部位的限制，可為中藥原植物和中藥材的品種鑒定提供更加準確可靠的手段，是中藥分子鑒定方法學上的創(chuàng)新[9]。因此，本研究將采用SSR指紋圖譜對開口箭及其混偽品進行DNA分子鑒定，建立開口箭的DNA指紋圖譜鑒定體系，為開口箭種質(zhì)資源鑒定和混偽品鑒定提供技術支持。

1 材 料

1.1 實驗材料

4個不同種的開口箭屬植物開口箭(T.chinensisBaker)、彎蕊開口箭(T.wattiiHook)、劍葉開口箭(T.ensifoliaWang & Tang)、筒花開口箭(T.delavayiFranchet)及3個不同種的百合科鈴蘭族其它屬植物萬年青(RohdeajaponicaRoth)、吉祥草(ReineckiacarneaKunth)、蜘蛛抱蛋(AspidistraelatiorBlume)的新鮮葉片采于陜西、湖北及云南等地(見表1)。野外采集新鮮的幼嫩葉片，放置于干凈自封袋中，硅膠干燥，常溫保存，供實驗使用。

1.2 實驗試劑與儀器

PowerPacTMHV型電泳儀(BIO-RAD公司)，UP H-II-40型超純水機(優(yōu)普)，KG-SX-500型滅菌鍋(Chamber公司)，Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，Eppendorf型移液器等。DNA Marker(pUC18 DNA/Mspl，北京天根生化科技有限公司)，PCR All-in-One PreMix(西安熱默爾生物科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 基因組DNA提取

開口箭基因組DNA的提取采用改良CTAB法[10]。抽提出來的DNA經(jīng)過濃度測定，A260nm/A280nm值在1.8～2.0為可用基因組DNA。

2.2 PCR擴增和電泳檢測

PCR反應體系的總體積為10 μL[11]，其中Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應在PCR擴增儀(Bio-rad S1000TM)上的運行程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度(每組引物的退火溫度見表2)下持續(xù)45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

在完成PCR循環(huán)48 h內(nèi)，取2 μL PCR擴增產(chǎn)物以165 V的恒定電壓在濃度為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳15 h，然后對電泳后的聚丙烯酰胺凝膠進行銀染和顯影。顯影完成之后，用凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel DOCTM XR+)采集圖像。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與指紋圖譜構建

對電泳后的凝膠圖像進行條帶統(tǒng)計，數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜采用人工讀帶的方式，只記錄主要帶型，忽略弱雜帶。根據(jù)每對SSR引物生成帶型間的差別直接對帶型進行分類編號，可得到不同個體的帶型編號，一個個體的DNA經(jīng)過不同引物擴增后，將獲得一系列帶型編號，按照固定的引物順序，串聯(lián)各帶型編號，形成一組數(shù)據(jù)(見表1)，便形成了該個體的分子指紋圖譜[12]。

將7對SSR引物在15份開口箭種質(zhì)及其混偽品材料擴增的電泳條帶記錄進行整理，再利用NTSYSpc 2.1統(tǒng)計分析軟件按Nei的方法計算開口箭種質(zhì)及其混偽品間的遺傳相似系數(shù)[13]。用算術平均非加權配組法(Unweighted Pair-Groupmethod with Arithmetic Mean，UPGMA)進行遺傳相似聚類分析并繪制各材料間的親緣關系聚類樹狀圖。

本研究SSR位點及其引物序列是基于開口箭設計開發(fā)的(由陜西理工大學植物分子生物學實驗室開發(fā)，將另文發(fā)表)，在基于2輪SSR多態(tài)性分析的基礎上，篩選能夠擴增出穩(wěn)定的帶型且不同材料之間差異明顯的SSR引物，從中選取了7個多態(tài)性高、重復性好、分辨率高的SSR引物對(見表2)作為擴增7個不同種的SSR譜帶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果表明，擴增條帶清晰，可以有效區(qū)分。統(tǒng)計分析了7對引物對全部15份開口箭種質(zhì)及其混偽品的擴增帶型后，構建其指紋圖譜。

2.4 PCR擴增和電泳檢測

本研究所用7對SSR引物均能對15份樣本進行擴增和電泳(圖1)。7對SSR引物擴增共產(chǎn)生了21個復等位基因位點，平均每對引物的復等位基因數(shù)為3.0；其中引物KKJSSR15的等位位點數(shù)最少，為2個；引物KKJSSR16的等位位點最多，為4個(見表2)。這表明本研究所用的SSR分子標記具有較高的多態(tài)性，而開口箭種質(zhì)資源及其混偽品表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性。研究同時發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性位點比較豐富的單個SSR引物，如KKJSSR16，由于其復等位基因數(shù)及特征譜帶有限，單一引物(位點)僅能將部分開口箭種質(zhì)進行區(qū)分，但采用多對引物(位點)的多個基因型的組合能有效地將15份開口箭種質(zhì)資源及其混偽品進行區(qū)分和準確鑒定。

注：1-KFP； 2-KLBGHZ； 3-KLBDDS； 4-KHFS； 5-KQS； 6-WHLS； 7-WHY1； 8-WHY2； 9-WZLM；10-WZKS； 11-JYKKJ； 12-THKKJ； 13-WNQ； 14-JXC； 15-ZZBD； M-DNA Marker

利用軟件NTSYS-pc2.10通過非加權平均法(UPMGA)計算開口箭及其混偽品種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，構建了15份開口箭及其混偽品種質(zhì)的UPGMA聚類分析圖，如圖2所示。

圖2 15份開口箭種質(zhì)資源與混偽品的UPGMA聚類圖

利用軟件GenAlEx 6.3 for Excel 2007對統(tǒng)計的條帶進行分析，基于SSR標記檢測獲得的Nei’s遺傳相似系數(shù)，構建主相關性分析(Principal Coordinated Analysis，PCoA)圖，結果如圖3所示。

圖3 15份開口箭種質(zhì)資源與混偽品的主相關性分析(PCoA)圖

從圖2和圖3中可見，根據(jù)遺傳關系的遠近，15份開口箭及其混偽品種質(zhì)大致可劃分為3大組，即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ。5個開口箭種質(zhì)(KFP、KLBGHZ、KQS、KLBDDS和KHFS)首先聚在一起組成組Ⅰ，5個不同產(chǎn)地的彎蕊開口箭個體(WHLS、WZLM、WHY1、WHY2和WZKS)聚在一起組成組Ⅱ，而與開口箭形態(tài)學相似的5個近緣種(THKKJ、JYKKJ、WNQ、JXC和ZZBD)因其親緣關系相對較遠，分散在組Ⅰ和組Ⅱ的外緣一起組成了組Ⅲ。

在組Ⅰ中，其親緣關系均比較近，遺傳相似度高，可分為兩個亞組，KFP、KLBGHZ、KQS為一個亞組，KLBDDS和KHFS為一個亞組；在第Ⅱ類群中，也可分為兩個亞組，WHLS和WZLM聚為一個亞組，剩下的聚為一個亞組，其中WHY1、WHY2因都采自陜西洋縣華陽，因此親緣關系近，遺傳相似度較高；第Ⅲ類群因其均為與開口箭形態(tài)學相似的近緣種，在植物分類學上同屬于百合科鈴蘭族，但畢竟不同種甚至不同屬，因此親緣關系較遠，遺傳相似度低。綜上所述，本研究所用的SSR分子標記能清楚地將開口箭種質(zhì)資源及其混偽品區(qū)分開，且區(qū)分度大，效果良好。

3 討 論

SSR標記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高；具有復等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性[14]；設計的引物序列決定每一個位點的位置，便于開發(fā)引物時不同實驗室相互間進行交流合作，獲得的資料能夠在不同實驗室重復并且共享[15]，因此SSR標記將會在開口箭種質(zhì)鑒定工作中發(fā)揮更加重要的作用。

本研究利用開口箭的7對SSR引物構建了開口箭種質(zhì)資源和混偽品的DNA指紋圖譜，7對SSR引物所產(chǎn)生的21個有效基因位點可對15份開口箭種質(zhì)及其混偽品進行準確有效地區(qū)分。此外，在開口箭DNA指紋圖譜構建的過程中，選用SSR標記的數(shù)量也是非常關鍵的[16]，這不僅因為其影響著DNA指紋圖譜的有效性和準確性，也決定著它所能區(qū)分開口箭種質(zhì)的數(shù)量，而SSR標記數(shù)量的確定主要取決于單個SSR標記擴增多態(tài)性位點的多少，對某一特定數(shù)量開口箭種質(zhì)而言，單個SSR標記擴增位點越多，DNA指紋圖譜構建中選用的SSR標記數(shù)量則越少[14]。

傳統(tǒng)的品種鑒定一般采用形態(tài)標記進行，但是鑒定周期往往比較長，存在著較大的誤差，一些性狀差異小的品種間鑒定困難[17]。DNA分子標記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異，用于品種鑒定時具有周期短，不受環(huán)境條件的影響，真實可靠等優(yōu)點[18]。開口箭及其混偽品之間性狀差異小，利用形態(tài)標記很難進行區(qū)分，發(fā)展DNA分子標記指紋圖譜對這些品種的鑒定具有重要意義。利用SSR標記構建開口箭種質(zhì)資源的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，為這些中藥材的鑒定奠定了基礎。

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[責任編輯：魏 強]

SSR fingerprinting study onTupistrachinensisgermplasms and their adulterants

CHEN Zheng1,2, ZHOU Tian-hua1

(1.College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000, China;2.Shaanxi Hanzhong Crested Ibis National Nature Reserve,Yangxian 723301, China)

With the aim to set up a molecular identification way forTupistrachinensisgermplasms and their adulterants, SSR DNA markers were employed to construct their DNA fingerprinting. PCR and polyacrylamide gel electrophoresis detection was carried out on 10T.chinensisgermplasms and 5 adulterants with 7 pair of polymorphism primers. As a result, theT.chinensisand its adulterants performed a high genetic diversity, 21 polymophic alleles were detected in total, with the average of 3.0 per loci; the DNA fingerprinting based on SSR molecular markers could distinguish the 10T.chinensisgermplasms and 5 adulterants from one another completely. The study provides a way of standardized analysis and market identification for theT.chinensisgermplasms and their adulterants.

TupistrachinensisBaker; SSR marker; fingerprinting; germplasm resources; adulterants identification

2016-11-19

2017-02-24

陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2015JM3115)；陜西省教育廳重點實驗室科研計劃項目(14JS017)

陳征(1992—)，男，陜西省洋縣人，陜西漢中朱鹮國家級自然保護區(qū)助理工程師，主要研究方向為野生動植物保護；[通信作者]周天華(1976—)，男，陜西省漢中市人，陜西理工大學講師，碩士生導師，博士，主要研究方向為植物分子生物學。

1673-2944(2017)02-0074-06

Q943.2

A