益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠胰腺miR-375表達水平和胰島功能的影響

袁 潔，張 軍，戴金穎，王順意，徐雪梅，趙 靜，劉 穎

益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠胰腺miR-375表達水平和胰島功能的影響

袁 潔1，張 軍2，戴金穎1，王順意1，徐雪梅1，趙 靜1，劉 穎2

目的 探討益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠胰腺組織中miR-375表達水平的影響，并分析其與胰島β細胞功能的相關性。方法 采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)加高脂飲食誘導2型糖尿病大鼠模型。設空白組、模型組、益氣養(yǎng)陰活血方(自擬) 高、中、低劑量治療組，于治療8周后處死大鼠。分別測定大鼠體質量、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hBG)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)光鏡下觀察胰島形態(tài)學變化，通過實時熒光定量PCR技術檢測胰腺組織中miR-375的表達水平。結果 經益氣養(yǎng)陰活血方治療后，大鼠的體質量、FBG、2hBG均不同程度降低(P<0.05)；HOMA-IR均有所降低，ISI HOMA-β均有所升高(P<0.05)；胰島細胞形態(tài)有不同程度改善；胰腺組織中的 miR-375 表達量顯著降低，模型組(2.29±0.91)，益氣養(yǎng)陰活血方低劑量組(0.33±0.21)，中劑量組(0.43±0.32)，高劑量組(0.48±0.19)，治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 益氣養(yǎng)陰活血方可改善胰島β細胞功能。其改善的原因可能與胰腺中miR-375表達下調有關。

益氣養(yǎng)陰活血方；2型糖尿病大鼠；miR-375；胰島β細胞功能

糖尿病多屬于中醫(yī)“消渴病”的范疇，由于其起病隱匿且病程漫長，在糖耐量受損階段及糖尿病早期，因無明顯的“三多一少”的臨床癥狀，往往被人們忽略，來醫(yī)院就診時往往發(fā)病已久。中醫(yī)自古就有“久病多虛、久病多瘀”之說，因此糖尿病患者中醫(yī)辨證多有氣陰兩虛兼有瘀血阻絡之征象。據(jù)報道，此類證型的發(fā)生率為60%左右[1]?；诖?，結合臨床實踐，自擬益氣養(yǎng)陰活血方(由太子參、黃芪、黃精、當歸、山萸肉、鬼箭羽、丹參、三七粉組成)治療消渴病辯證屬氣陰兩虛兼瘀者，取得了良好的治療效果。本研究旨在通過測定2型糖尿病大鼠胰腺中miR-375 的表達以及ISI、HOMA-IR等指標，并觀察光鏡下胰島細胞的變化，探討不同劑量益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠胰島β細胞的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 選取SPF級5周齡雄性SD大鼠50只，體質量( 240.0±4.1)g，由解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所提供，動物許可證號：SCXK-(軍)-2014-0001。將其飼養(yǎng)于華北理工大學動物實驗中心清潔級動物房。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分組，空白組10只常規(guī)喂養(yǎng)，其余40只大鼠喂以高脂飼料( 每克飼料含58%脂肪，25.6%糖類，16.4%蛋白質，北京華阜康生物科技股份有限公司) 。飼養(yǎng)4周后，除空白組外其余給予大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ(pH 4.4)溶液。72 h后，測空腹血糖高于11.1 mmol/L 的SD大鼠入組，隨機分組，每組10只。模型組10只，給予等體積生理鹽水；低劑量益氣養(yǎng)陰活血方組(低劑量組)10只，給予1.2 ml/(100 g·d)，中劑量益氣養(yǎng)陰活血方組(中劑量組)10只，給予1.6 ml/(100g·d)，高劑量益氣養(yǎng)陰活血方組(高劑量組)10只,給予 2.0 ml/(100 g·d)。由于造模和灌胃過程中的損耗，最終各組SD大鼠只數(shù)為：空白組10只，模型組9只，低劑量益氣養(yǎng)陰活血方組9只，中劑量益氣養(yǎng)陰活血方組9只，高劑量益氣養(yǎng)陰活血方組8只。

1.2 相關指標測定 于開始灌胃當天，喂藥后2、4、6、8 周測量大鼠體質量、空腹血糖、餐后2 hPG。末次給藥后腹主動脈取血，分離血清，放于-20 ℃冰箱中保存，用于大鼠生化指標檢測；于胰尾處取小塊組織，以備HE染色。切取胰腺部分組織置于EP管中，在-80 ℃低溫冰箱凍存，用于miRNA-375表達水平的檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA)檢測試劑盒檢測各組大鼠血清中FINS的含量，按試劑盒說明書操作步驟嚴格操作。計算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5[2]，胰島素敏感指數(shù)ISI，計算公式 ISI=In(1/FPG×FINS)[3]，其中 FINS 單位為μg/L，F(xiàn)BG單位為 mmol/L。胰島素分泌指數(shù)HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。

1.3 實時熒光定量PCR檢測miR-375表達

1.3.1 胰腺總RNA的提取 采用Trizol(美國Ambion公司)法提取大鼠胰腺組織總RNA，紫外吸收測定法對RNA含量進行鑒定，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。準備miRNA-375和U6引物：均設計合成于上海生工有限公司。引物序列設計如表1。

表1 胰腺總RNA提取的引物序列設計

1.3.2 反轉錄成cDNA 以RNA為模板，使用M-MLV反轉錄酶進行第一鏈cDNA的合成，構建20 μl的反應體系：莖環(huán)引物1 μl，樣品RNA 2 μg (1/濃度×1000 μl)，10 mMDNTP 1μl，加DEPC水至10 μl?；旌衔镌?5 ℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻1 min，短暫離心后加入以下組織：5×第一鏈合成緩沖液4 μl，0.1MDTT 2 μl，RNaseOUTTM核酸酶抑制劑 1 μl，M-MLV反轉錄酶1 μl，DEPC水2 μl。在離心管中輕輕將各種成分混合，吹打均勻，上機進行反轉錄，反轉錄反應時間設置為：37 ℃反應52 min、72 ℃反應15 min、4 ℃終止反應，以此程序合成cDNA第一鏈，標記后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增反應 建立20μl PCR擴增反應液體系如表2。

表2 PCR擴增反應體系

加樣后短暫離心至無氣泡后放入PCR儀進行擴增實驗，其反應體系條件為：95 ℃預變性10 min一個循環(huán)，95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。所有試驗項目均在華北理工大學基礎醫(yī)學院、河北省慢性疾病重點實驗室、唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室完成。

2 結 果

2.1 一般狀態(tài)及體質量的變化

2.1.1 一般情況 2型糖尿病胰島素抵抗大鼠造模成功后，與空白組比較，模型大鼠毛發(fā)干枯發(fā)黃，體質量顯著增加，活動力減弱，反應遲緩，進食量、飲水量及尿量均明顯增加，對外界刺激反應不靈敏。各治療組較模型組大鼠狀態(tài)良好。

2.1.2 實驗0、2、4、6、8周體質量變化 各組大鼠用藥前后體質量比較結果顯示：0周時，與空白組比較，模型組與各治療組大鼠體質量顯著升高(P<0.05)，而模型組與各治療組比較無差異；組內比較，用藥2周開始益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組體質量均不同程度減輕(P<0.05)；用藥8周后各組大鼠與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量組均有顯著降低(P<0.05)，且3組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 大鼠0、2、4、6、8周體質量變化

2.2 用藥前后FBG、2hBG比較 用藥前各組大鼠比較，模型組及益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組的FBG、2hPG未見明顯差異，但與空白組比較均有明顯升高(P<0.05)；用藥后各組大鼠與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組FBG、2hPG均有不同程度的降低(P<0.05)，其中益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組降低2hPG效果最為明顯，優(yōu)于其他兩組(P<0.05)。組內比較，用藥后益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組較用藥前FBG和2hPG均可不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 2型糖尿病大鼠各組FBG及2 hBG的比較 ；mmol/L)

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與本組用藥前比較，③P<0.05

2.3 胰島形態(tài)學改變 由胰腺HE染色圖片可以觀察到，正常大鼠的胰島多為圓形或橢圓形的細胞團，邊緣平滑界線鮮明，分散于胰腺腺泡之間，β細胞分布均勻，形態(tài)規(guī)則(圖2A)。模型組大鼠胰島萎縮、細胞破裂、排列紊亂，胰島邊緣β細胞出現(xiàn)聚集，細胞大小不均勻，胰腺呈分葉狀，見少量炎細胞浸，潤腺泡上皮變性、壞死，間質血管充血，呈現(xiàn)明顯的病理性改變(圖2B)。而各給藥組均有不同程度的改善(高劑量圖2C，中劑量圖2D，低劑量圖2E)，胰島萎縮和胰島細胞退行性改變的程度略有好轉，其中益氣養(yǎng)陰活血方中劑量治療組效果最為顯著，細胞結構趨于完整、規(guī)則，胰島內細胞密度及分布接近空白組。

圖2 2型糖尿病大鼠實驗后胰島形態(tài)學(HE，×400)

2.4 胰腺miRNA-375表達水平的變化 根據(jù)目的基因miRNA-375和內參U6擴增曲線顯示的CT值計算miRNA-375在大鼠胰腺組織中的相對表達量，其計算公式采用2-△△Ct相對定量法。結果顯示：與空白組相比，模型組miRNA-375的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4)。與模型組相比，益氣養(yǎng)陰活血方各劑量組的miRNA-375相對表達量均有不同程度的降低(P<0.05，表4)；其中，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組降低miRNA-375表達水平的效果更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表5)。

表4 空白組和模型組大鼠miRNA-375相對表達量的比較 ±s)

注：與空白組比較，①P<0.05

表5 模型組與不同劑量組大鼠miRNA-375相對表達量比較 ±s)

注：與模型組比較，①P<0.05

3 討 論

糖尿病是最常見的內分泌代謝性疾病之一，其中90%是以胰島β細胞功能障礙和胰島素抵抗(IR)為主要因素的2型糖尿病[4]。因此，提高胰島素分泌和降低胰島素抵抗已成為治療2型糖尿病的重要措施。微小RNA(microRNA，miRNA)是近些年發(fā)現(xiàn)的一類22～25 nt 的非編碼的內源性RNA分子，其在分子級別參與了多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對細胞的某些基因的調控，對胰島細胞發(fā)育、β細胞分化及胰島素分泌中發(fā)揮直接傳遞作用,甚至在葡萄糖和脂質代謝等多方面都起一定的調控作用[5]，且2型糖尿病患者胰島組織中miR-375異常表達，可從胰島素分泌、β細胞凋亡及增殖等多個方面調控胰島功能[6-8]。

2型糖尿病是一種復雜的代謝性疾病，常以胰島素抵抗和胰島β細胞衰竭為特征[9]。發(fā)病初期，胰島β細胞分泌功能代償性增強，出現(xiàn)胰島素抵抗和高胰島素血癥。隨著病程的進展，胰島β細胞分泌功能出現(xiàn)失代償，表現(xiàn)為胰島β細胞衰竭和細胞凋亡，進一步加重糖尿病的代謝紊亂，并導致一系列并發(fā)癥。胰島β細胞的功能衰退是2 型糖尿病發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié)，因此，如何保護和防止胰島β細胞衰竭和細胞凋亡成為防治糖尿病的重點。

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對保護胰島β細胞功能、防止細胞凋亡有積極作用，表現(xiàn)出較好的發(fā)展前景。基于此，筆者根據(jù)多年中醫(yī)臨床經驗及用藥觀察，從傳統(tǒng)中醫(yī)理論消渴病“從氣陰兩虛論治”、“從瘀論治”等觀點出發(fā)，針對該病氣陰兩虛兼瘀的病機采用“益氣養(yǎng)陰、活血化瘀”的治療原則，自擬益氣養(yǎng)陰活血方應用于臨床，并取得一定療效。該方以太子參、黃芪、黃精、山萸肉、葛根來益氣滋陰、氣陰雙補，解痙生津，當歸、丹參補血活血，鬼箭羽、丹皮、三七粉清熱涼血兼活血化瘀。諸藥合用使氣陰得補、瘀血得化。

大部分MicroRNA在生物體中呈特異性表達，可調節(jié)生物體的發(fā)育、神經分化、細胞增殖、凋亡等。miR-375是在進化中高度保守的MicroRNA，miR-375在維持胰島β細胞結構和數(shù)量，調節(jié)胰島分泌功能中發(fā)揮重要作用。經過實驗研究證實，高糖環(huán)境下，miR-375呈高表達狀態(tài)，通過其靶蛋白Mtpn、Pdk1、Prkaa1、Adipor2、Insr、Jak2、Nfkb2、Pik3ca等調控相關信號通路，使胰島β細胞對高血糖刺激脫敏，導致分泌胰島素能力下降[10，11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可加劇棕櫚酸誘導的胰島β細胞凋亡[12]。以上表明miR-375可作為改善胰島β細胞功能，治療2 型糖尿病的靶點。

本研究主要探討益氣養(yǎng)陰活血方對2型糖尿病大鼠胰腺組織中miR-375表達水平的影響，并分析其與胰島β細胞功能的相關性。整體實驗結果顯示，益氣養(yǎng)陰活血方可以降低 2型糖尿病大鼠體質量、FBG、2hPG；INS、HOMA-IR均有所降低，ISI均有所升高；病理學檢查發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰活血方可以改善胰島結構紊亂；RT-PCR檢測miR-375表達結果顯示益氣養(yǎng)陰活血方可以使糖尿病大鼠胰腺組織的miR-375表達明顯下降，提示其胰島β細胞功能改善作用可能與調控miR-375的表達有關。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血方能有效降低糖尿病大鼠血糖，并改善胰島β細胞功能，為中藥復方制劑治療糖尿病，改善胰島β細胞功能障礙提供一定的實驗基礎。但是，MicroRNA在細胞功能的調節(jié)過程中會同時調控多種靶基因，參與多個生理病理過程的調節(jié)，或者多個MicroRNA作用于同一個基因，甚至可能MicroRNA之間也存在著調節(jié)作用[13]。因此，中藥對胰島β細胞的保護作用機制也可能涉及多個靶點，不同的信號通路之間可能也有相互作用，值得進一步研究和探討。

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(2016-08-29收稿 2017-01-19修回)

(責任編輯 岳建華)

Effects of Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction on miR-375 in pancreatic tissue and on functions of β cells in diabetic rat models

YUAN Jie1,ZHANG Jun2,DAI Jinying1,WANG Shunyi1, XU Xuemei1,ZHAO Jing1,and LIU Ying2.

1.North China University of Science and Technology, Tangshan, 063000, China ；2.Department of Endocrinology, Tangshan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Tangshan 063000, China

Objective To study the effect of Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction on miR-375 in pancreatic tissue and on the function of β cells in diabetic rat models.Methods Diabetic rat models were established using high-energy diet and intravenous injection of streptozocin(STZ).The rats were divided into blank group,model group,and high-,medium- and low-dose Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction groups. After 8 weeks of administration，body weight ( BW) was measured and blood was collected for detection of fasting blood glucose (FBG),fasting blood insulin(FINS),insulin sensitive index(ISI) and for calculation of the indexes of insulin resistance(HOMA-IR). Before the rats were sacrificed，2-hour plasma glucose(2hPG) was determined. The histopathological features in the islet tissue were examined with HE staining. The level of miR-375 in the islet tissue was detected with qPCR. Single factor analysis of variance was used to sort out the data.Results After the treatment with Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction, the levels of WB,FBG,2hPG,FINS and HOMA-IR decreased significantly (P<0.05) compared with the model group while the ISI was increased significantly(P<0.05).The islet apoptosis was reduced by the administration of this decoction.Compared with model group (2.29±0.91),the levels of miR-375 in the high dose Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction group(0.48±0.19),medium dose group(0.43±0.32)and low dose group(0.33±0.21)were decreased significantly(P<0.05).Conclusions Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction can improve islet beta cell function，and the mechanism may be associated with the down-regulation of the level of miR-375 in islet tissues.

Yi Qi Yang Yin Huo Xue decoction; T2DM model; miR-375; islet beta cell function

河北省中醫(yī)藥管理局2015年度中醫(yī)藥類科研計劃課題(2015049)

袁 潔，碩士。

1.063000 唐山，華北理工大學；2.063000，唐山市中醫(yī)醫(yī)院內分泌一科

張 軍，E-mail：tszhangj@126.com

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