斑馬魚對水源水質(zhì)的生物預(yù)警研究

李清雪，張寶中，車克鎧

斑馬魚對水源水質(zhì)的生物預(yù)警研究

李清雪1，張寶中2，車克鎧3

（1.河北工程大學(xué) 學(xué)科規(guī)劃與建設(shè)處，河北 邯鄲 056038；2.河北工程大學(xué) 能源與環(huán)境工程學(xué)院，河北 邯鄲056038；3.滄州規(guī)劃設(shè)計研究院，河北 滄州 061000）

針對水源水質(zhì)典型污染物（重金屬、有機(jī)物），以斑馬魚為試驗(yàn)生物，研究目標(biāo)污染物對斑馬魚的毒性效應(yīng)，用SPSS軟件計算目標(biāo)污染物對斑馬魚的半致死濃度，同時進(jìn)行目標(biāo)污染物對斑馬魚死亡率的Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果表明：重金屬和有機(jī)物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；斑馬魚能夠靈敏檢測水源污染，在污染物濃度極低時（Hg2+為8 μg/L、Cd2+為1.5 mg/L、氯苯為12 mg/L），斑馬魚仍然有響應(yīng)，因此斑馬魚的毒性測試方法可以用來對水源污染進(jìn)行生物預(yù)警。

水源安全；生物預(yù)警；斑馬魚；重金屬；有機(jī)物

近年來，我國水污染事件頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅飲用水水源安全[1]。2005年以來，我國相繼發(fā)生了松花江硝基苯水污染、太湖藍(lán)藻暴發(fā)、山西汾河水庫水質(zhì)污染、湘江鎘污染、湖北枝江化學(xué)原料污染等水源水質(zhì)污染事件[2-3]。如何在事故發(fā)生的第一時間應(yīng)用科學(xué)合理的預(yù)警監(jiān)測技術(shù)實(shí)現(xiàn)預(yù)警至關(guān)重要，其有助于及時識別水質(zhì)污染和水質(zhì)異常[4]。目前研究的新型水質(zhì)綜合毒性都是利用生物監(jiān)測來完成的[5-8]。本文以岳城水庫為研究水域，以斑馬魚作為試驗(yàn)生物，研究其對重金屬和有機(jī)污染物的響應(yīng)，此實(shí)驗(yàn)對及時發(fā)現(xiàn)岳城水庫當(dāng)?shù)厝嗣竦娘嬘盟踩[患，及后續(xù)污染防治具有重要的科學(xué)意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試斑馬魚購于邯鄲市某花鳥魚蟲市場，魚長（30±5） mm、重（0.3±0.1) g，在實(shí)驗(yàn)室（22±1)oC直徑為30 cm的魚缸內(nèi)馴養(yǎng)12 d。每天喂食并清理糞便和殘余餌料，實(shí)驗(yàn)前24 h停止喂食，馴養(yǎng)期間未出現(xiàn)魚體死亡情況。

HgCl2、Pb(NO3)2、Cd(NO3)2、K2Cr2O7、As2O3、苯酚、二甲苯、甲苯、氯苯、苯均為分析純，購于天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

本試驗(yàn)用水取自岳城水庫，水質(zhì)為Ⅱ水，偶爾會出現(xiàn)Ⅲ水，在用于實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行曝氣充氧使得溶解氧≧8.6 mg/L。

母液配制：重金屬以離子濃度為10 mg/L配置母液；對于有機(jī)物，依次移取所需試劑、一定量助溶劑無水乙醇和乳化劑吐溫-80于一小燒杯中混勻，用蒸餾水定容到所需刻度。其中助溶劑和乳化劑不超過0.2%。

1.2 試驗(yàn)方法

首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到污染物對斑馬魚全致死濃度和全不致死濃度（表1），然后在此濃度范圍內(nèi)按照幾何級數(shù)梯度設(shè)置5個濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，每個濃度重復(fù)3次，同時設(shè)空白對照組。實(shí)驗(yàn)在直徑為30 cm的魚缸內(nèi)進(jìn)行，每個魚缸放入10尾魚，每12 h換一次水，以保證試液濃度和溶解氧含量，光暗比12：12（以小時計），溫度（22±1)oC，實(shí)驗(yàn)周期為96 h，每12 h記錄斑馬魚死亡情況及其中毒癥狀，并及時撈出死魚。

表1 實(shí)驗(yàn)溶液濃度設(shè)定Tab.1 Concentration of test solution

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0計算污染物對斑馬魚半致死濃度LC50、Pearson相關(guān)系數(shù)和95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果分析

2.1 重金屬對斑馬魚的毒性效應(yīng)

斑馬魚的死亡率隨不同重金屬濃度的發(fā)展如圖1～圖5。

圖1 Hg2+對斑馬魚死亡率影響Fig.1 Effect of Hg2+on zebrafish mortality

圖2 Pb2+對斑馬魚死亡率影響Fig.2 Effect of Pb2+on zebrafish mortality

圖3 Cd2+對斑馬魚死亡率影響Fig.3 Effect of Cd2+on zebrafish mortality

圖4 Cr6+對斑馬魚死亡率影響Fig.4 Effect of Cr6+on zebrafish mortality

圖5 As3+對斑馬魚死亡率影響Fig.5 Effect of As3+on zebrafish mortality

在重金屬對斑馬魚的毒性效應(yīng)試驗(yàn)中，空白組均未出現(xiàn)魚的異常反應(yīng)。當(dāng)Hg2+、Pb2+、Cd2+、Cr6+、As3+濃度分別超過引起斑馬魚死亡的初始濃度20 μg/L、2 mg/L、2 mg/L、24 mg/L、15 mg/L時，隨著重金屬離子濃度的增加，斑馬魚死亡率逐漸升高；當(dāng)其濃度分別達(dá)65 μg/L、9.5 mg/L、6.5 mg/L、50 mg/L、80 mg/L時，斑馬魚全部死亡。通過實(shí)驗(yàn)觀察：斑馬魚對重金屬中毒初期，均表現(xiàn)出劇烈、無序游動，身體失衡，同時伴有抽搐現(xiàn)象，中毒癥狀嚴(yán)重程度與濃度大小基本成正比。對各種重金屬濃度和斑馬魚死亡率進(jìn)行劑量-效應(yīng)相關(guān)性分析，得到Pearson相關(guān)系數(shù)R。數(shù)據(jù)結(jié)果分析得到96 h半致死濃度LC50，以及95%置信區(qū)間（表2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所關(guān)注的五種重金屬離子，Cr6+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、As3+對斑馬魚的LC50見表2，毒性大小依次為Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根據(jù)魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[8]，Hg2+為極高毒，Pb2+、Cd2+為高毒，Cr6+、As3+為中毒。各種金屬離子濃度與斑馬魚死亡率存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 有機(jī)物對斑馬魚的毒性效應(yīng)

在有機(jī)物對斑馬魚的毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，對照組沒有出現(xiàn)異常癥狀。當(dāng)苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯濃度分別到達(dá)45、85、40、27、160 mg/L時，斑馬魚開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，隨著有機(jī)物濃度的增加死亡率升高（圖6～圖10）。當(dāng)各有機(jī)物濃度分別達(dá)到115、178、123、75、340 mg/L時，斑馬魚全部死亡。通過實(shí)驗(yàn)觀察：斑馬魚受有機(jī)污染物影響均表現(xiàn)出興奮并快速游動，開始豎游、側(cè)游、偶爾出現(xiàn)掙扎性竄動，且伴有麻醉現(xiàn)象。

對各有機(jī)物濃度與斑馬魚死亡率進(jìn)行劑量-效應(yīng)相關(guān)性分析得到Pearson相關(guān)系數(shù)R。數(shù)據(jù)結(jié)果分析得到96 h半致死濃度LC50以及95%置信區(qū)間（表3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：五種有機(jī)污染物中，苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯對斑馬魚的LC50見表3，毒性大小依次為：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根據(jù)魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯為中毒，苯為低毒，各種有機(jī)污染物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 各金屬離子對斑馬魚96 h半致死濃度LC50、95%置信區(qū)間及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Metal ion 96 h-LC50, 95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

表3 各有機(jī)物對斑馬魚96 h半致死濃度LC50、95 %置信區(qū)間及相關(guān)系數(shù)Tab.3 Organic of 96 h-LC50,95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

圖6 苯酚對斑馬魚死亡率影響Fig.6 Effect of phenolon zebrafish mortality

圖7 甲苯對斑馬魚死亡率影響Fig.7 Effect of toluene on zebrafish mortality

圖8 二甲苯對斑馬魚死亡率影響Fig.8 Effect of xylene on zebrafish mortality

圖9 氯苯對斑馬魚死亡率影響Fig.9 Effect of chlorobenzene on zebrafish mortality

圖10 苯對斑馬魚死亡率影響Fig.10 .Effect of benzene on zebrafish mortality

3 結(jié)論

1）通過對比重金屬離子對斑馬魚96 h半致死濃度LC50，金屬離子毒性大小為：Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根據(jù)魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，其中Hg2+為極高毒，Pb2+、Cd2+為高毒，Cr6+、As3+為中毒。各種金屬離子對斑馬魚死亡率存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

2）根據(jù)對比有機(jī)污染物對斑馬魚96 h半致死濃度LC50，有機(jī)污染物毒性大小為：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根據(jù)魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯為中毒，苯為低毒。各種有機(jī)污染物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3）用重金屬離子與有機(jī)污染物對斑馬魚的死亡狀況加以對比。重金屬離子對斑馬魚致死程度比較高，有機(jī)污染物對斑馬魚的有較強(qiáng)的麻醉作用。

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（責(zé)任編輯 王利君）

Biological early warning for water quality on zebrafish

LI Qingxue1,ZHANG Baozhong2,CHE Kekai3

(1.Department of Disciplines Plan and Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；2.College of Urban Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；3.Institute of Plan and Design, Traffic South Street, Xinhua District, Hebei Cangzhou, 061000, China)

The early warning of water source pollution with biological monitoring method is studied. The zebrafish is used as the experimental object. And the SPSS according to behavioral difference of fish in different toxicity environment. The study shows that the dose effect relationship was exists between heavy metals, organic compounds and zebrafish mortality. As a result, toxicity testing methods on zebrafish can be used to carry on biological pre-alarm for water pollution.

Water security; biological monitoring; zebrafish; heavy metal; organic compound

X832

A

1673-9469（2017）01-0061-05

10.3969/j.issn.1673-9469.2017.01.014

投稿日期：2016-09-12 特約專稿

水利部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201401030）

李清雪（1964-），女，河北大名人，博士，教授，從事水處理方面研究。