轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥新品系G19-349的抗旱特性

齊學(xué)禮，張建周，李 艷，趙明忠，韓劉鵬，胡 琳，許為鋼

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450002)

轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥新品系G19-349的抗旱特性

齊學(xué)禮，張建周，李 艷，趙明忠，韓劉鵬，胡 琳，許為鋼

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450002)

為明確轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥G19-349的抗旱特性，以分子檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株和受體對照濟(jì)麥19為材料，利用小區(qū)試驗測定和分析了澆二水和澆四水條件下小麥葉片葉綠素含量、氣體交換、葉綠素?zé)晒獾裙夂蠀?shù)，SOD、POD和CAT活性，以及MDA含量和籽粒產(chǎn)量，同時通過大區(qū)試驗分析了在澆三水條件下小麥水分消耗特征參數(shù)和籽粒產(chǎn)量。對供試材料分子檢測結(jié)果表明，目的基因已整合到小麥基因組中，并已正確轉(zhuǎn)錄。小區(qū)試驗結(jié)果表明，在澆二水條件下，G19-349的旗葉葉綠素相對含量，氣體交換參數(shù)Pn、Gs、Tr和Ci，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和ΦPSⅡ，以及三種抗氧化酶活性和產(chǎn)量均顯著高于對照，而MDA含量顯著低于對照；澆四水條件下，G19-349的各項指標(biāo)與對照均無顯著差異。大區(qū)試驗結(jié)果表明，在澆三水條件下，G19-349較對照濟(jì)麥19耗水量顯著降低，而水分利用效率和產(chǎn)量均顯著增加。說明轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥G19-349在缺水條件下具有較高的抗氧化和光合能力，這是其在有限灌水條件下較受體濟(jì)麥19具有較好水分利用特性的生理基礎(chǔ)。

小麥；干旱； GmDREB1基因

干旱缺水是農(nóng)業(yè)面臨的嚴(yán)峻問題之一。在世界范圍內(nèi)，水分虧缺所造成的小麥減產(chǎn)遠(yuǎn)超其他非生物逆境所導(dǎo)致的產(chǎn)量損失[1-3]，干旱缺水已是許多地區(qū)小麥生產(chǎn)的主要限制因素，抗旱節(jié)水已成為小麥遺傳育種研究的重要目標(biāo)。轉(zhuǎn)基因育種能打破基因在不同物種間交流的障礙，克服傳統(tǒng)育種方法難以解決的問題[4]，近年來已發(fā)展成為小麥遺傳育種的重要研究方向[5]。因此，發(fā)掘利用抗旱節(jié)水基因，開展抗旱轉(zhuǎn)基因小麥新品種培育研究，將有助于增強(qiáng)小麥的持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)能力，對保障我國糧食安全具有重要意義。干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(dehydration responsive element binding protein,DREB)是一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，它通過特異性的結(jié)合啟動子中的順式作用元件來調(diào)控多個與植物抗逆相關(guān)的基因表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因植物對逆境脅迫適應(yīng)性[6-8]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬有志研究員課題組成功將來源于大豆的脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子 GmDREB1基因?qū)氲叫←溒贩N濟(jì)麥19中，獲得了抗旱特性較對照明顯提高的轉(zhuǎn)基因小麥新品系G19-349。本課題組將該轉(zhuǎn)基因小麥新品系引進(jìn)到了河南省，研究了其在不同水分處理下的生理特性、水分利用效率和產(chǎn)量，以期為該抗旱轉(zhuǎn)基因小麥品系的應(yīng)用和新品種培育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與 GmDREB1基因的分子檢測

雖然基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到了小麥之中，但為了說明本次試驗所用的轉(zhuǎn)基因小麥確實為陽性轉(zhuǎn)基因植株，且陽性率已經(jīng)較高，我們對試驗材料進(jìn)行分子檢測，以說明試驗材料的可靠性。

1.1.1 供試材料

供試材料為T4代轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥新品系G19-349及其受體對照品種濟(jì)麥19，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，上述材料種植于國家黃淮海轉(zhuǎn)基因小麥中試與產(chǎn)業(yè)化基地本部(位于河南省新鄉(xiāng)市平原新區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地)。該基地是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)建設(shè)的從事轉(zhuǎn)基因小麥相關(guān)研究的專業(yè)機(jī)構(gòu)，設(shè)置有隔離柵欄和門衛(wèi)監(jiān)控室，周圍500 m內(nèi)均無小麥種植，符合轉(zhuǎn)基因小麥田間試驗的安全隔離距離要求。

1.1.2 GmDREB1基因的PCR檢測

參照Lin等[9]的方法提取DNA，對轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行單株P(guān)CR檢測。 GmDREB1引物F:5′-CGGGTAGAAGAAGTCCAACATCG-3′，R:5′-AGTCGGGCTTGAGATTGAGAGAG-3′，引物序列由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所馬有志研究員課題組提供，并由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。該引物擴(kuò)增目的片段為423 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，10 mmol·L-1dNTP0.4 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，DNA 1.0 μL，5 U·μL-1Taq酶0.1 μL，H2O 16.1 μL，總體積20 μL；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min(5 V·cm-1)、溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并計算轉(zhuǎn)基因品系的PCR陽性率[10]。1.1.3 GmDREB1基因的實時熒光定量PCR檢測

用植物總RNA提取試劑盒(CW Biotech,Beijing,China)提取試驗材料的總RNA，用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara,Japan)進(jìn)行cDNA合成。TaPHR1引物和反應(yīng)條件同1.1.2。Actin引物F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′，R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATT ACC-3′。Actin基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；反應(yīng)體系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、H2O 7.8 μL、20 μmol·L-1上游引物各0.1 μL、cDNA 2 μL，總體積20 μL；用Toyobo公司SYBR Green RT-PCR試劑盒，反應(yīng)體系在Bio-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，基因相對表達(dá)量參照Livak等的2-ΔΔCt法進(jìn)行計算[11]，將野生型對照濟(jì)麥19的 GmDREB1基因表達(dá)水平定為1。

1.2 小區(qū)試驗

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗于2014-2015年度在國家黃淮海轉(zhuǎn)基因小麥中試與產(chǎn)業(yè)化基地進(jìn)行。2014年10月播種前期降水多，底墑足，出苗好，小麥拔節(jié)后降雨量較少，土壤墑情差，抽穗到成熟期試驗地點出現(xiàn)連續(xù)高溫天氣，田間出現(xiàn)干旱脅迫。2014-2015年度小麥生育期間苗期墑情較好，拔節(jié)后田間連續(xù)出現(xiàn)干旱脅迫。在河南新鄉(xiāng)小麥高產(chǎn)田全生育期一般澆水3～4次。試驗采用品種(系)和灌水二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，其中灌水設(shè)澆二水(冬灌、孕穗期灌水)和澆四水(冬灌、返青期、孕穗期、灌漿期)兩個水平，3次重復(fù)，小區(qū)面積6.67 m2，基本苗180萬株·hm-2，每次灌水700 m3·hm-2，灌水方式為漫灌。不同灌水處理的小區(qū)之間設(shè)置5 m寬的隔離帶(保護(hù)行)，隔離帶全生育期不澆水。底施尿素225 kg·hm-2和二銨300 kg·hm-2，返青期追施尿素150 kg·hm-2，澆二水處理用播肥料機(jī)將肥料直接施到土壤中，澆四水處理隨澆水施肥，其余栽培管理措施同大田生產(chǎn)管理，于小麥開花后16 d測定各項生理指標(biāo)，成熟期調(diào)查每個小區(qū)的有效穗數(shù)，全小區(qū)收獲測定籽粒產(chǎn)量。

1.2.2 葉綠素相對含量測定

各小區(qū)選取10片長勢一致的旗葉，使用SPAD-502型葉綠素計(MINOLTA CAMERA,Japan)，測定每片旗葉中部的SPAD值，計算平均值。1.2.3 氣體交換參數(shù)測定

氣體交換參數(shù)測定參照Hu等[12]的方法。利用便攜式光合測定儀(Ciras-3,PP-systems,USA)測定各小區(qū)供試材料的旗葉凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci) 和蒸騰速率(Tr)，CO2濃度設(shè)為380 μL·L-1，光強(qiáng)設(shè)為1 500 μmol·m-2·s-1，每小區(qū)6次重復(fù)。

1.2.4 熒光參數(shù)測定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定參照Genty等[13]的方法。旗葉先暗適應(yīng)20 min后，再利用飽和脈沖式熒光儀(FMS-2,Hansatech Co.,UK)測定并計算旗葉的熒光參數(shù)，6次重復(fù)。PSⅡ的最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；ФPSⅡ=(Fm-Fs)/Fm。

1.2.5 抗氧化酶活性測定

田間選取長勢一致的小麥旗葉用液氮處理，放入-80 ℃冰箱保存。稱取剪碎的小麥葉片0.5 g，加5 mL預(yù)冷的提取液(pH 7.8的磷酸緩沖液)，冰浴研磨，于4 ℃下12 000×g離心20 min，上清液即為提取液。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性按Tan等[14]的方法進(jìn)行測定，3次重復(fù)。

1.2.6 丙二醛(MDA)含量測定

MDA含量測定參照Heath and Packer[15]的方法，略作修改。取2 mL旗葉提取液，加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL，于沸水浴上加熱10 min，迅速冷卻。于4 500轉(zhuǎn)·min-1離心10 min。取上清液于532、600 nm波長下，測定吸光度，3次重復(fù)。

1.3 大區(qū)試驗

1.3.1 田間試驗設(shè)計

每材料種植200 m2，返青期、拔節(jié)期和灌漿期分別灌水500、450和625 m3·hm-2，基本苗180萬株·hm-2，栽培管理措施同豐產(chǎn)田，成熟期隨機(jī)選取3點進(jìn)行土壤含水量測定，同時每點選取2.4 m2測產(chǎn)，調(diào)查有效穗數(shù)，取成熟籽粒500粒稱重，換算成千粒重，3次重復(fù)。1.3.2 土壤水分消耗特征參數(shù)測定

用土鉆取0～200 cm土層的土壤樣品，每20 cm為一層，取土后立即裝入鋁盒，稱鮮重，110 ℃烘干至恒重，稱干重，用于計算土壤含水量。土壤含水量=(土壤鮮質(zhì)量-土壤干質(zhì)量)÷土壤干質(zhì)量×100%。

土壤貯水量=土壤容重×土壤含水量×土層厚度[9]，分別計算20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 cm厚度的土壤貯水量，然后求和，可得每公頃土壤貯水量。

水分利用效率=籽粒產(chǎn)量÷作物耗水量[10]

作物耗水量=播前土壤貯水量-收獲期土壤貯水量+灌水量+降水量[16]

土壤水分消耗參數(shù)均測定3次重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計分析

用DPS7.05進(jìn)行統(tǒng)計分析，Microsoft Excel 2003繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因 GmDREB1的分子檢測

2.1.1 目的基因 GmDREB1的PCR檢測

PCR檢測結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因植株與陽性對照均擴(kuò)增出423 bp的目的條帶，而未轉(zhuǎn)化植株和空白均未擴(kuò)增出該條帶(圖1)，共檢測轉(zhuǎn)基因植株117株，其中陽性單株101棵，陽性率達(dá)到86.32%，表明 GmDREB1基因已整合到小麥基因組中并已基本穩(wěn)定遺傳。

1：Maker I；2～8：部分轉(zhuǎn)基因植株；9：野生型對照；10：水；11：陽性對照質(zhì)粒。

1:Marker I; 2-8:Transgenic plants;9:Wild-type control;10:Water；11:Positive control.

圖1 GmDREB1在轉(zhuǎn)基因植株中的PCR檢測

Fig.1 PCR analysis of GmDREB1 gene in transgenic wheat

2.1.2 目的基因 GmDREB1的實時熒光定量PCR檢測

經(jīng)實時熒光定量PCR分析，轉(zhuǎn)基因小麥G19-349中 GmDREB1基因的表達(dá)量是其對照濟(jì)麥19的17.38倍(圖2)，二者差異達(dá)極顯著水平，說明外源基因已在轉(zhuǎn)基因小麥中正確轉(zhuǎn)錄。

2.2 G19-349與濟(jì)麥19的生理特性比較

2.2.1 不同水分處理下G19-349與濟(jì)麥19的葉綠素相對含量

澆四水處理下，轉(zhuǎn)基因小麥G19-349的葉綠素相對含量與其受體對照濟(jì)麥19無顯著差異。澆二水處理下，G19-349、濟(jì)麥19的葉綠素相對含量分別較澆四水處理下降9.66%和19.14%；G19-349較濟(jì)麥19高13.16%，二者差異達(dá)顯著水平(圖3)。

圖柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平上存在顯著性差異。下圖同。

Different letters above the columns indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same in the other figures.

圖3 兩種灌水處理下G19-349與濟(jì)麥19的葉綠素相對含量

Fig.3 Relative chlorophyll content of G19-349 and Jimai 19 under two irrigation treatments

2.2.2 不同水分處理下G19-349與濟(jì)麥19的氣體交換參數(shù)

澆四水處理下，轉(zhuǎn)基因小麥G19-349的Pn、Gs、Tr和Ci與其受體對照濟(jì)麥19均無顯著差異。澆二水處理下，G19-349和濟(jì)麥19的Pn、Gs、Tr和Ci均較澆四水處理顯著降低；G19-349的Pn、Gs、Tr和Ci較濟(jì)麥19分別高11.55%、17.26%、18.56%和14.27%，差異均達(dá)顯著水平(圖4)。這表明水分脅迫下氣孔限制因素是轉(zhuǎn)基因小麥與對照光合速率降低的主要原因，但轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)艿降臍饪紫拗菩∮趯φ铡?/p>

2.2.3 不同水分處理下G19-349與濟(jì)麥19的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

澆四水處理下，轉(zhuǎn)基因小麥G19-349的Fv/Fm和ΦPSⅡ與其受體對照濟(jì)麥19均無顯著差異。澆二水處理下，G19-349和濟(jì)麥19的Fv/Fm和ΦPSⅡ均較澆四水處理顯著降低；G19-349的Fv/Fm和ΦPSⅡ較濟(jì)麥19分別高7.04%和17.37%，差異均達(dá)顯著水平(圖5)，表明水分脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥和對照的最大光化學(xué)效率和實際光化學(xué)效率均顯著下降，但轉(zhuǎn)基因小麥仍能維持相對較高的光化學(xué)效率。

圖4 兩種灌水處理下G19-349與濟(jì)麥19的氣體交換參數(shù)

2.2.4 不同水分處理下G19-349與濟(jì)麥19的抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量

澆四水處理下，轉(zhuǎn)基因小麥G19-349的SOD、POD、CAT活性和MDA含量與對照濟(jì)麥19均無顯著差異。澆二水處理下，G19-349和濟(jì)麥19的SOD、POD和CAT活性均較澆四水處理顯著降低，MDA含量顯著上升，但G19-349的SOD、POD和CAT酶活性較濟(jì)麥19分別高12.20%、15.56和16.18%，而MDA含量低11.99%，差異均達(dá)顯著水平(圖6)，表明干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的抗氧化酶活性較高，其葉片膜脂過氧化程度較輕，表現(xiàn)出較好的抗氧化特性。

2.3 小區(qū)試驗中G19-349與濟(jì)麥19的產(chǎn)量及其構(gòu)成

由表1可知，澆二水處理下，G19-349較濟(jì)麥19顯著增產(chǎn)10.32%，千粒重較濟(jì)麥19增加5.2%，這是其增產(chǎn)的主要原因；澆四水處理下，G19-349較濟(jì)麥19增產(chǎn)3.15%，差異未達(dá)顯著水平。

2.4 大區(qū)試驗中G19-349與濟(jì)麥19的水分利用效率和產(chǎn)量差異

由表2可知，G19-349較濟(jì)麥19耗水量降低5.89%，而產(chǎn)量和水分利用效率分別增加9.37%和16.39%。G19-349穗數(shù)和穗粒數(shù)較濟(jì)麥19略有降低，而千粒重顯著高于濟(jì)麥19。表明G19-349具有節(jié)水和高產(chǎn)特性。

圖5 兩種灌水處理下G19-349與濟(jì)麥19的熒光參數(shù)

圖6 兩種灌水處理下G19-349與濟(jì)麥19的抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量

處理Treatment品種(系)Variety(line)穗數(shù)Numberofspikes/(104·hm-2)穗粒數(shù)Grainnumberperspike千粒重1000?kernelweight/g產(chǎn)量Yield/(kg·hm-2)澆二水Twoirrigation濟(jì)麥19Jimai19556．55±7．14a21．51±0．58a40．69±1．05b4869．10±83．12bG19?349580．15±7．09a21．63±0．55a42．83±0．98a5371．75±127．36a澆四水Fourirrigation濟(jì)麥19Jimai19560．70±11．75a26．13±0．17a47．22±0．53a6918．15±401．71aG19?349596．90±2．10a25．05±0．24a47．72±0．27a7136．35±51．54a

同列數(shù)據(jù)后不同字母分別表示兩個材料間均在0.05水平上存在顯著性差異。表2同。

Different letters after the values in a column indicate significant difference between two materials at 0.05 level. The same in table 2.

表2 大田條件下G19-349和濟(jì)麥19的水分消耗、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子對信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)控起非常重要的作用，當(dāng)作物遭受干旱、鹽害等非生物逆境脅迫時，DREB亞族可同時啟動多個與植物抗逆相關(guān)的分子途徑，提高作物的抗逆能力，從而使作物農(nóng)藝性狀得到綜合改良[17-18]。利用轉(zhuǎn)基因的方法將植物抗逆調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到植物中，已成為改良植物抗逆性的重要途徑之一[19-22]。

前人研究表明，植物的光合作用對環(huán)境脅迫反應(yīng)極為敏感，受到干旱等逆境脅迫后植物的光合速率顯著降低，且氣孔限制因素和非氣孔限制因素均可引起植物光合速率降低[23]，本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下小麥的氣孔導(dǎo)度較正常處理顯著下降，而胞間二氧化碳濃度也顯著下降(圖2)，表明氣孔限制是轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥與受體對照光合速率下降的主要原因，轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)艿降臍饪紫拗戚^小，是其在干旱脅迫下維持相對較高碳同化速率的原因。Han等[24]研究了轉(zhuǎn)NFYB轉(zhuǎn)錄因子擬南芥在干旱脅迫下的氣體交換參數(shù)變化，得到了與本研究相似的結(jié)果。

干旱脅迫下小麥旗葉光合速率的降低，是因為葉片光合元件的結(jié)構(gòu)受到破壞或活性受到抑制。有研究報道，干旱直接或間接影響植物的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)[25]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可反映逆境對植物光合機(jī)構(gòu)(主要是PSⅡ)的影響，以及光合機(jī)構(gòu)對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，熒光參數(shù)Fv/Fm和ФPSⅡ?qū)δ婢趁{迫反應(yīng)十分敏感，F(xiàn)v/Fm反映PSⅡ的最大光化學(xué)效率，ФPSⅡ反映光下PSⅡ的實際光化學(xué)效率實線[26]。本研究中，干旱脅迫強(qiáng)烈抑制了小麥旗葉PSⅡ的光化學(xué)活性，而外源 GmDREB1基因的表達(dá)可以減輕轉(zhuǎn)基因小麥葉片PSⅡ損傷，從而使其維持相對較高的光合電子傳遞鏈活性和光化學(xué)效率。干旱脅迫下小麥葉片內(nèi)部發(fā)生的生理生化變化是其生理表型發(fā)生變化的根本原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的葉綠素含量顯著高于受體對照，這可能是由于轉(zhuǎn)基因小麥具有較高的光合電子傳遞活性，產(chǎn)生的過剩光能和有害物質(zhì)較少，減輕了干旱對葉綠素分子的破壞程度。此外，在干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因小麥較受體對照濟(jì)麥19具有較高的抗氧化酶活性，這可能是因為外源基因上調(diào)了小麥自身的抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)。Bhatnagar-Mathur等[27]研究了轉(zhuǎn) DREB1A基因花生的抗旱特性，得到與本研究一致的結(jié)果，較高的抗氧化酶活性可有效清除干旱脅迫下產(chǎn)生的有害物質(zhì)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)和葉綠素分子。丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其在逆境條件下的含量高低可反映植物受逆境傷害的程度。前人在小麥和玉米等作物上研究均發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下耐旱品種的丙二醛含量顯著低于不耐旱品種[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的丙二醛含量顯著低于受體對照，說明其膜脂過氧化程度較輕，原因可能是轉(zhuǎn)基因小麥的抗氧化酶活性增強(qiáng)，有效清除了活性氧類物質(zhì)，保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)。

本研究中，轉(zhuǎn)基因小麥較受體對照濟(jì)麥19增產(chǎn)的因素是千粒重提高，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥較對照具有更好的生理特性是其獲得較高千粒重的重要原因，這與Shavrukov等[29]在轉(zhuǎn) TaDREB3基因小麥上的研究結(jié)果一致。

本研究表明，干旱脅迫下外源 GmDREB1基因可降低小麥的氣孔限制，減輕PSⅡ損傷，維持較高的光合電子傳遞活性和葉綠素含量，還通過上調(diào)抗氧化酶活性，減輕其膜脂過氧化程度，使轉(zhuǎn)基因小麥在干旱脅迫下維持較高的光合速率和水分利用效率，并最終較對照獲得更高產(chǎn)量，因而轉(zhuǎn) GmDREB1基因小麥新品系G19-349在河南省表現(xiàn)出了較好的抗旱節(jié)水特性。下一步我們將以河南省主推小麥品種和本課題組苗頭品系為受體，對 GmDREB1基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，同時將開展該基因在不同遺傳背景下的作用機(jī)制研究，以期為抗逆小麥轉(zhuǎn)基因育種提供試驗材料和理論參考。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所馬有志研究員課題組提供試驗材料。

[1] 趙麗英,鄧西平,山 侖.水分虧缺下作物補(bǔ)償效應(yīng)類型及機(jī)制研究概述[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2004,15(3):523.

ZHAO L Y,DENG X P,SHAN L.A review on types and mechanisms of compensation effect of crops under water deficit [J].ChineseJournalofAppliedEcology,2004,15(3):523.

[2] FAROOP M,HUSSAIN M,SIDDIQUE K H M.Drought stress in wheat during flowering and grain-filling periods [J].CriticalReviewsinPlantSciences,2014,33(4):331.

[3] 張龍龍,楊明明,董 劍,等.三個小麥新品種不同生育階段抗旱性的綜合評價[J].麥類作物學(xué)報,2016,36(4):426.

ZHANG L L,YANG M M,DONG J,etal.Comprehensive analysis of drought resistance of three new wheat cultivars at different growth stages [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(4):426.

[4] 黎 裕,王建康,邱麗娟,等.中國作物分子育種現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].作物學(xué)報,2010,36(9):1425.

LI Y,WANG J K,QIU L J,etal.Crop molecular breeding in China:current status and perspectives [J].ActaAgronomicaSinica,2010,36(9):1425.

[5] 肖興國,張愛民,聶秀玲.轉(zhuǎn)基因小麥的研究進(jìn)展與展望[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2008,8(2):111.

XIAO X G,ZHANG A M,NIE X L.Wheat genetic transformation:advances and prospects [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2008,8(2):111.

[6] 王巧燕,陳 明,邱志剛,等.一個新的編碼大豆DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,18(5):625.

WAMG Q Y,CHEN M,QIU Z G,etal.Cloning and identification of a new gene encoding DREB transcription factors fromGlycinemaxL.[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,2005,18(5):625.

[7] HSIEH T S,LEE J T,YANG P T,etal.Heterology expression of theArabidopsisC-repeat/dehydration response element binding factor1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato [J].Plant Physiology,2002,129(3):1086.

[8] CHEN M,WANG Q Y,CHENG X G,etal. GmDREB2,a soybean DRE-binding transcription factor,conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants [J].BiochemicalBiophysicalResearchCommunications,2007,353(2):299.

[9] LIN R C,DING Z S,LI L B,etal.A rapid and efficient DNA minipreparation suitable for screening transgenic plants [J].PlantMolecularBiologyReporter,2001,19(4):379.

[10] 吳 瓊,許為鋼,李 艷,等.田間條件下轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC基因小麥的光合生理特性[J].作物學(xué)報,2011,37(11):2046.

WU Q,XU W G,LI Y,etal.Physiological characteristics of photosynthesis in transgenic wheat with maize-pepc gene under field conditions [J].ActaAgronomicaSinica,2011,37:2046.

[11] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression date using real-time quantitative PCR and 2-ΔΔCtmethod [J].Methods,2001,25:402.

[12] HU L,LI Y,XU W,etal.Improvement of the photosynthetic characteristics of transgenic wheat plants by transformation with the maize C4phosphoenolpyruvate carboxylase gene [J].PlantBreeding,2012,131:231.

[13] GENTY B,BRIANTAIS J,BAKER N R.The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence [J].BiochimicaetBiophysicaActa,1989,990:87.

[14] TAN W,LIU J,DAI T,etal.Alterations in photosynthesis and antioxidant enzyme activity in winter wheat subjected to post-anthesis water-logging [J].Photosynthetica,2008,46:21.

[15] HEATH R L and PACKER L.Photoperoxidation in isolated chloroplasts:I.Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation [J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1968,125(1):189.

[16] 王德梅,于振文.灌溉量和灌溉時期對小麥耗水特性和產(chǎn)量的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2008,19(9):1965.

WANG D M,YU Z W.Effects of irrigation amount and stage on water consumption characteristics and grain yield of wheat [J].ChineseJournalofAppliedEcology,2008,19(9).

[17] 張艷艷,張永麗,于振文,等.測墑補(bǔ)灌對冬小麥耗水特性、旗葉水勢、籽粒產(chǎn)量和水分利用率的影響[J].麥類作物學(xué)報,2012,32(3):510.

ZHANG Y,ZHANG Y,YU Z,etal.Effects of supplemental irrigation based on soil moisture test on water consumption characteristics,water potential of flag leaf,grain yield and WUE in winter wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2012,3:25.

[18] 成雪峰,張鳳云,柴守璽.灌水處理對春小麥穗部性狀和產(chǎn)量的影響 [J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2010,28(3):13.

CHENG X F,ZHANG F Y,CHAI S X.The effects of different water supplies on spring wheat spikelet traits and yield [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2010,28(3):13.

[19] 鄭甲成,徐兆師,胡銀崗,等.小麥DREB轉(zhuǎn)錄因子TaAIDFa的互作蛋白篩選 [J].麥類作物學(xué)報,2010,30(2):189.

ZHENG J C,XU Z S,HU Y G,etal.Screening for the interacting proteins of DREB transcription factorTaAIDFain wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2010,30(2):189.

[20] 倪志勇,徐兆師,李連城,等.DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫中的作用機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].麥類作物學(xué)報,2008,28(6):1100.

NI Z Y,XU Z S,Li L C,etal.Mechanism and application prospect of DREB transcription factors in plant stress resistance [J].JournalofTriticeaeCrops,2008,28(2):1100.

[21] 榮紅穎,張立全,楊鳳萍.DREB1B基因在轉(zhuǎn)基因小麥后代的穩(wěn)定表達(dá)[J].分子植物育種,2009,7(3):437.

RONG H Y,ZHANG L Q,Yang F P,etal.Stable expression of exogenous DREB1B in transgenic wheat progeny [J].MolecularPlantBreeding,2009,7(3):437.

[22] JIANG Q,HU Z,ZHANG H,etal.Overexpression of GmDREB1 improves salt tolerance in transgenic wheat and leaf protein response to high salinity [J].TheCropJournal,2014,2(2):120.

[23] ASHRAF M,HARRIS P J C.Photosynthesis under stressful environments:an overview [J].Photosynthetica,2013,51(2):163.

[24] HAN X,TANG S,AN Y,etal.Over expression of the poplar NFYB7 transcription factor confers drought tolerance and improves water-use efficiency inArabidopsis[J].JournalofExperimentalBotany,2013,64:4589.

[25] CHEN H X,LI W J,An S Z,etal.Dissipation of excess energy in mehler-peroxidase reaction inRumexleaves during salt shock [J].Photosynthetica,2004,42(1):117.

[26] MAXWELL K,JOHNSON G N.Chlorophyll fluorescence-a practical guide [J].JournalofExperimentalBotany,2000,51(345):659.

[27] BHATNAGAR-MATHUR P,DEVI M J,VADEZ V,etal.Differential antioxidative responses in transgenic peanut bear no relationship to their superior transpiration efficiency under drought stress [J].JournalofPlantPhysiology,2009,166(11):1207.

[28] 武玉葉,李德全.土壤水分脅迫下小麥葉片滲透調(diào)節(jié)與光合作用[J].作物學(xué)報,1999,25(6):752.

WU Y Y,LI D Q.Osmotic adjustment and photosynthesis of wheat leaves under soil water stress [J].ActaAgronomicaSinica,1999,25(6):752.

[29] SHAVRUKOV Y,BAHO M,LOPATO S,etal.The TaDREB3 transgene transferred by conventional crossings to different genetic backgrounds of bread wheat improves drought tolerance [J].PlantBiotechnologyJournal,2016,14(1):313.

Drought Resistance Characteristics of Transgenic Wheat Line G19-349 Containing GmDREB1 Gene

QI Xueli,ZHANG Jianzhou,LI Yan,ZHAO Mingzhong,HAN Liupeng,HU Lin,XU Weigang

(Wheat Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences/ National Engineering Laboratory for Wheat/ Henan Key Laboratory for Wheat Biology/ Key Laboratory for Wheat Biology and Genetic Breeding in Central Huang-Huai Region,Ministry of Agriculture,Zhengzhou,Henan 450002,China)

Drought may be one of the most important abiotic stresses limiting crop growth and yield. It was reported that more than 50% of the wheat planting area is affected by periodic drought in recent years,and drought has become a main limiting factor of wheat production. Here,we report the drought tolerance of a transgenic wheat line G19-349 containing GmDREB1 gene. The transgenic wheat line G19-349 and its receptor parent Jimai 19 were used as materials. Relative chlorophyll content,gas exchange and chlorophyll fluorescence parameters,the activity of antioxidant enzyme including superoxide dismutase(SOD) peroxidase(POD) and catalase(CAT),the content of malondialdehyde(MDA),and grain yield were determined. The results showed that G19-349 had higher SPAD value,net photosynthetic rate(Pn),transpiration rate(Tr),stomatal conductance(Gs),intercellular CO2concentration(Ci),maximum photochemical efficiency(Fv/Fm),actual photochemical efficiency of photosystem Ⅱ(ФPSⅡ) the activity of SOD,POD and CAT,and grain yield,but lower content of MDA than those of Jimai 19 under treatment with twice irrigation. While these indicators showed no significant difference between G19-349 and Jimai 19,under treatment with four irrigation. Compared with Jimai 19,G19-349 exhibited lower water consumption,but higher water use efficiency and grain yield,under treatment with three irrigation. The results indicate that G19-349 had higher chlorophyll content and activity of antioxidant enzyme than Jimai19,which can alleviate membrane lipid peroxidatione,maintain relatively higher photosynthetic efficiency,and ultimately its drought tolerance was improved.

Wheat(TriticumaestivumL.); Drought stress; GmDREB1 gene

2016-10-24

2016-12-13 基金項目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08002002-006)；國家現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-3-1-9) 第一作者E-mail：xueliqi888@163.com；同等貢獻(xiàn)作者張建周 E-mail：zhangjianzhou00@163.com 通訊作者：許為鋼(E-mail：xuwg1958@163.com)

S512.1；S336

A

1009-1041(2017)04-0491-09