S組山羊草屬 Psy1基因片段的克隆與序列分析

王建武，何心堯，王 輝，夏先春，何中虎,5

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家小麥改良中心，北京 100081； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 4.國際玉米小麥改良中心，墨西哥特斯科科 56237； 5.CIMMYT中國辦事處，北京 100081)

S組山羊草屬 Psy1基因片段的克隆與序列分析

王建武1,3，何心堯2,4，王 輝3，夏先春2，何中虎2,5

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家小麥改良中心，北京 100081； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 4.國際玉米小麥改良中心，墨西哥特斯科科 56237； 5.CIMMYT中國辦事處，北京 100081)

類胡蘿卜素含量是影響小麥面制品色澤的主要因素，而 Psy1基因則是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因。為了了解小麥近緣種S組山羊草的 Psy1基因多樣性分布規(guī)律，以高大山羊草、雙角山羊草及西爾斯山羊草為材料，應(yīng)用同源基因克隆技術(shù)對(duì)其進(jìn)行 Psy1基因克隆。結(jié)果表明，利用分子標(biāo)記YP7B-5檢測獲得的8個(gè)新 Psy1-S1等位變異的部分序列覆蓋了 Psy1基因的第二外顯子和第二內(nèi)含子的全部以及第三外顯子93.1%的區(qū)域。在與包括來自普通小麥的 Psy1-B1d、栽培二粒小麥的 Psy1-B1k以及擬斯卑爾脫山羊草的 Psy1-S1a、 Psy1-S1b、 Psy1-S1c對(duì)應(yīng)部分的序列綜合分析發(fā)現(xiàn)一致性高達(dá)93.4%～98.5%，而且編碼區(qū)序列差異均為同義突變，沒有造成編碼氨基酸的變化。而第二內(nèi)含子序列則存在數(shù)個(gè)SNP及InDel，尤其是 Psy1-S1h的161 bp大片段插入和 Psy1-S1i的177 bp大片段缺失，導(dǎo)致與其他 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異產(chǎn)生較大的長度差異。分析表明，內(nèi)含子的差異是造成 Psy1基因多樣性的主要原因。

小麥籽粒黃色素；山羊草；八氫番茄紅素合成酶基因 Psy1；基因片段克隆

面粉及面制品的色澤是衡量小麥品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，而黃色素含量是影響面制品顏色的主要因素[1-3]。位于小麥第七部分同源群的 Psy1基因則是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因[4-6]，決定面粉黃色素含量。大量研究鑒定了普通小麥及其近緣種 Psy1等位變異共計(jì)57個(gè)[5-14]。針對(duì) Psy1-A1位點(diǎn)，Zhang和Dubcovsky[5]在硬粒小麥中克隆了 Psy1-A1l；Ravel等[6]在普通小麥中克隆了 Psy1-A1ca、 Psy1-A1cb、 Psy1-A1ka、 Psy1-A1kb 、 Psy1-A1ra、 Psy1-A1rb 、 Psy1-A1x ；He等[7-9]在普通小麥中克隆了 Psy1-A1a、 Psy1-A1b 、 Psy1-A1c ，在硬粒小麥中克隆了 Psy1-A1d 、 Psy1-A1e ；Singh等[10]在硬粒小麥中克隆了 Psy-A1o；Howitt等[11]在普通小麥克隆了 Psy1-A1p 、Psy1-A1q、 Psy1-A1r、 Psy1-A1s ；Wang等[12]在烏拉爾圖小麥中克隆了 Psy1-A1f、 Psy1-A1g，在野生一粒小麥和栽培一粒小麥中克隆了 Psy1-A1h、 Psy1-A1i 、 Psy1-A1j ，在野生二粒小麥、栽培二粒小麥和斯卑爾脫小麥中克隆了 Psy1-A1k 、 Psy1-A1m 、 Psy1-A1n；Crawford等[13]在普通小麥中克隆了 Psy1-A1t 。針對(duì) Psy1-B1位點(diǎn)，Zhang和Dubcovsky[5]在硬粒小麥中克隆了 Psy1-B1n 、 Psy1-B1o ；Ravel等[6]在普通小麥中克隆了 Psy1-B1aa 、 Psy1-B1ca ；He等[8-9]在普通小麥中克隆了 Psy1-B1a 、 Psy1-B1b 、 Psy1-B1c、 Psy1-B1d、 Psy1-B1e ，在硬粒小麥中克隆了 Psy1-B1f、 Psy1-B1g ；Wang等[12]在野生二粒小麥、栽培二粒小麥和斯卑爾脫小麥中克隆了 Psy1-B1h 、 Psy1-B1i 、 Psy1-B1j 、 Psy1-B1k、 Psy1-B1l、 Psy1-B1m。針對(duì) Psy1-D1位點(diǎn)，Wang等[12]在粗山羊草和斯卑爾脫小麥中克隆了 Psy1-D1b、 Psy1-D1c、 Psy1-D1d、 Psy1-D1e、 Psy1-D1f、 Psy1-D1h、 Psy1-D1i、 Psy1-D1j；Wang等[12]和Crawford等[13]在普通小麥中克隆了 Psy1-D1a、 Psy1-D1g、 Psy1-D1k、 Psy1-D1l、 Psy1-D1m。其中，來自近緣種的 Psy1等位變異30個(gè)[5，9-10，12]，占52.6%，極大豐富了普通小麥 Psy1等位基因遺傳多樣性。此外，Wang等[12]獲得了小麥B基因組可能的主要供體擬斯卑爾脫山羊草S基因組的3個(gè) Psy1等位變異 Psy1-S1a、 Psy1-S1b、 Psy1-S1c。山羊草屬是小麥改良的重要基因資源，但S組山羊草屬的高大山羊草、雙角山羊草、西爾斯山羊草的 Psy1基因還未被克隆。鑒于此，本研究以高大山羊草、雙角山羊草、西爾斯山羊草為材料，采用同源克隆技術(shù)發(fā)掘新的 Psy1基因等位變異，旨在發(fā)現(xiàn)S組山羊草的 Psy1基因多樣性分布規(guī)律，為小麥品質(zhì)改良提供豐富的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

3套S組山羊草屬種，總計(jì)11份材料。其中，4份高大山羊草材料(Y152、Y153、Y154、Y155)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家作物種質(zhì)資源中心提供； 2份高大山羊草(PI604107、PI604119)、2份雙角山羊草(CIae47、CIae70)及1份西爾斯山羊草(PI599137)由首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；2份雙角山羊草(CWI4250、CWI4266)由國際玉米小麥改良中心提供。

1.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增

DNA提取參照Lagudah等[15]。 PCR反應(yīng)在MJ Research PTC-200 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 50 ng，Taq酶1 U(北京天根生化科技公司)或LA-Taq酶1 U(大連寶生物工程有限公司)，上、下游引物(5 μmol·L-1)各1.0 μL，dNTPs(25 μmol·L-1)0.2 μL，10×PCR緩沖液2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。

1.3 目的基因片段的克隆及測序

根據(jù)已克隆的 Psy1-A1、 Psy1-B1/ Psy1-S1和 Psy1-D1等位變異的保守序列開發(fā)了一個(gè)針對(duì)S組山羊草屬的分子標(biāo)記YP7B-5(上游引物：5′-GGACCTTGCTGATGACGGAG-3′，下游引物：5′-GGGGAACTTGGTGATGGTGTC-3′)，以檢測11份S組山羊草材料的 Psy1等位變異。PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段約為800 bp。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目標(biāo)條帶連接至pMD18-T載體上進(jìn)行克隆測序。測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司(http://www.augct.com)和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(http://www.sangon.com)完成。

1.4 序列分析

應(yīng)用DNAMAN軟件(http://www.lynnon.com)將得到的擴(kuò)增片段序列與來自普通小麥及其近緣種對(duì)應(yīng)的 (Psy1-B1/ Psy1-S1)等位基因進(jìn)行序列比對(duì)，在確定外顯子和內(nèi)含子位置的同時(shí)進(jìn)一步檢測可能存在的SNP和InDel。

2 結(jié)果與分析

2.1 Psy1-S1等位變異鑒定結(jié)果

利用標(biāo)記YP7B-5檢測11份S組山羊草(4個(gè)雙角山羊草、1個(gè)西爾斯山羊草、6個(gè)高大山羊草)，發(fā)現(xiàn)其存在豐富的多態(tài)性(圖1)。隨后對(duì)它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，4份雙角山羊草YP7B-5擴(kuò)增片段序列完全一致，經(jīng)鑒定為新的等位變異，命名為 Psy1-S1d ；1份西爾斯山羊草YP7B-5擴(kuò)增片段的序列經(jīng)鑒定為新的等位變異，命名為 Psy1-S1e ；6份高大山羊草YP7B-5擴(kuò)增片段的序列經(jīng)鑒定均為新的等位變異，即 Psy1-S1f 、 Psy1-S1g 、 Psy1-S1h、 Psy1-S1i、 Psy1-S1j 和 Psy1-S1k(圖2)。這8個(gè) Psy1-S1新等位變異的YP7B-5擴(kuò)增片段序列覆蓋了 Psy1基因的第二外顯子和第二內(nèi)含子的全部區(qū)域以及第三外顯子的絕大部分區(qū)域(93.1%)(表1)。

2.2 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異的長度分析

為了更好地解析 Psy1-B1/ Psy1-S1等位基因序列的特點(diǎn)，將Wang等[12]構(gòu)建的普通小麥及其近緣種 Psy1等位變異系統(tǒng)發(fā)育樹中共同擁有B組和S組的β4簇里5個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位基因及本研究發(fā)現(xiàn)的8個(gè) Psy1-S1等位基因綜合在一起分析。其中，β4簇里5個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異具有很高的序列一致性，包括來自普通小麥的 Psy1-B1d，來自栽培二粒小麥的 Psy1-B1k，以及來自擬斯卑爾脫山羊草的 Psy1-S1a、 Psy1-S1b和 Psy1-S1c。這13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異對(duì)應(yīng)的YP7B-5擴(kuò)增序列在長度上表現(xiàn)出了一定的變異，最短為615 bp( Psy1-S1i)，最長為927 bp( Psy1-S1h)，都是由內(nèi)含子長度差異造成的，而外顯子均無差異，第二外顯子為51 bp，包含的第三外顯子部分為161 bp(表1)。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：Y152(高大山羊草， Psy1-S1f，779 bp)；2：Y153(高大山羊草， Psy1-S1g，739 bp)；3：Y154(高大山羊草， Psy1-S1h，927 bp)；4：Y155(高大山羊草， Psy1-S1i，615 bp)；5：PI604107(高大山羊草， Psy1-S1f，778 bp)；6：PI604119(高大山羊草， Psy1-S1k，776 bp)；7：CIae47(雙角山羊草， Psy1-S1d，779 bp)；8：CWI4250(雙角山羊草， Psy1-S1d，779 bp)；9：CWI4266(雙角山羊草， Psy1-S1d，779 bp)；10：CIae70(雙角山羊草， Psy1-S1d，779 bp)；11：PI599137(西爾斯山羊草， Psy1-S1e，801 bp)。

M:DNA Ladder DL2000; 1:Y152(Aegilopslongissima, Psy1-S1f,779 bp); 2:Y153(Ae.longissima, Psy1-S1g,739 bp); 3:Y154(Ae.longissima, Psy1-S1h,927 bp); 4:Y155(Ae.longissima, Psy1-S1i,615 bp); 5:PI604107(Ae.longissima, Psy1-S1j,778 bp); 6:PI604119(Ae.longissima, Psy1-S1k,776 bp); 7:CIae47(Ae.bicornis, Psy1-S1d,779 bp); 8:CWI4250(Ae.bicornis, Psy1-S1d,779 bp); 9:CWI4266(Ae.bicornis, Psy1-S1d,779 bp); 10:CIae70(Ae.bicornis, Psy1-S1d,779 bp); 11:PI599137(Ae.searsii, Psy1-S1e,801 bp)

圖1 分子標(biāo)記YP7B-5檢測11份S組山羊草的電泳圖

Fig.1 PCR amplification with molecular marker YP7B-5 in eleven lines ofAegilopsspecies comprising S genome

2.3 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異的序列分析

這13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異對(duì)應(yīng)的YP7B-5擴(kuò)增序列一致性為93.4%～98.5%，其編碼區(qū)序列差異較小，僅存在15個(gè)SNP，包括第2外顯子2個(gè)SNP以及第3外顯子的13個(gè)SNP，均為同義突變，沒有造成編碼氨基酸的變化(表2、表3、圖2)。在第2外顯子中， Psy1-B1k 、 Psy1-S1a、 Psy1-S1b、 Psy1-S1d、 Psy1-S1e、 Psy1-S1f、 Psy1-S1h、 Psy1-S1i、 Psy1-S1j、 Psy1-S1k完全相同。 Psy1-B1d、 Psy1-S1c完全相同，并與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1g與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。在第3外顯子中， Psy1-B1d、 Psy1-S1a完全相同。 Psy1-B1k與 Psy1-S1a共有3個(gè)SNP。 Psy1-S1b與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1c與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1d與 Psy1-S1a共有3個(gè)SNP。 Psy1-S1e與 Psy1-S1a共有6個(gè)SNP。 Psy1-S1f與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1g與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1h與 Psy1-S1a共有3個(gè)SNP。 Psy1-S1i與 Psy1-S1a僅有1個(gè)SNP。 Psy1-S1j與 Psy1-S1a共有8個(gè)SNP。 Psy1-S1k與 Psy1-S1a共有3個(gè)SNP。

表1 13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異YP7B-5擴(kuò)增區(qū)域的長度多態(tài)性

Psy1-A1、 Psy1-B1/ Psy1-S1和 Psy1-D1等位變異第二外顯子和第三外顯子的全長分別為51和173 bp。

The sizes of the 2ndexon and the 3rdexon at the Psy1-A1, Psy1-B1/Psy1-S1 and Psy1-D1 loci are 51 and 173 bp,respectively.

表2 13個(gè) Psy1-B1/Psy1-S1等位變異YP7B-5擴(kuò)增區(qū)域序列(下三角部分)及其編碼蛋白序列(上三角部分)的一致性比較

表3 13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異外顯子序列的單核苷酸多態(tài)性

Psy1-B1/Psy1-S1等位變異外顯子序列多態(tài)性均是與 Psy1-S1a比較的結(jié)果；突變堿基后括號(hào)中的序數(shù)詞為其所在位置。

The SNPs were exhibited between Psy1-S1a and other Psy1-B1/ Psy1-S1 alleles;The location of SNP of each exon at the Psy1-B1/ Psy1-S1 loci was indicated in the parentheses.

相對(duì)編碼區(qū)而言，非編碼區(qū)序列表現(xiàn)出較大差異，存在數(shù)個(gè)SNP及InDel(表4、圖2)。在第2內(nèi)含子中，這13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異存在很多SNP，變異范圍從14( Psy1-S1g)到29( Psy1-S1i)。與 Psy1-S1a相比，在第2內(nèi)含子中 Psy1-S1d、 Psy1-S1f、 Psy1-S1h、 Psy1-S1i、 Psy1-S1j存在1個(gè)2 bp插入(5′-AA-3′)； Psy1-S1c存在1個(gè)5 bp插入(5′-GTTTT-3′)； Psy1-S1b、 Psy1-S1e、 Psy1-S1h、 Psy1-S1i存在1個(gè)10 bp插入(5′-CACAGTGTCA-3′)； Psy1-S1e存在1個(gè)16 bp插入(5′-GCCCACATTTTGCATT-3′)； Psy1-B1d存在1個(gè)18 bp插入(5′-CACAGTGTGTC AGTGTCA-3′)；值得注意的是， Psy1-S1h相比其他 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異在第2內(nèi)含子多了1個(gè)161 bp大片段插入，這是造成其與其他 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異產(chǎn)生長度差異的主要原因(表1、圖2)。同 Psy1-S1a相比，在第2內(nèi)含子 Psy1-S1g、 Psy1-S1i存在1個(gè)1 bp缺失(5′-T-3′)， Psy1-B1d、 Psy1-S1j、 Psy1-S1k存在1個(gè)1 bp缺失(5′-C-3′)， Psy1-B1k、 Psy1-S1e、 Psy1-S1i存在1個(gè)1 bp缺失(5′-G-3′)， Psy1-S1e、 Psy1-S1g存在1個(gè)1 bp缺失(5′-T-3′)； (Psy1-B1d、) Psy1-S1b、 Psy1-S1c存在1個(gè)4 bp缺失(5′-AATC-3′)， Psy1-S1c還存在1個(gè)4 bp缺失(5′-TTTT-3′)； Psy1-B1d、 Psy1-S1b、 Psy1-S1d、 Psy1-S1e、 Psy1-S1f、 Psy1-S1g、 Psy1-S1h、 Psy1-S1j、 Psy1-S1k存在1個(gè)5 bp缺失(5′-CTGTA-3′)； Psy1-S1h存在1個(gè)11 bp缺失(5′-TCCCCT GTTGC-3′)； Psy1-S1c、 Psy1-S1h存在1個(gè)12 bp缺失(5′-AATTGAACTAGT-3′)； Psy1-S1g存在1個(gè)36 bp缺失(5′-CATTTCAGATCCTCA GAAAGGGCATGCCCACATTTT-3′)；值得注意的是， Psy1-S1i還存在1個(gè)177 bp缺失，導(dǎo)致與其他 Psy1-B1/Psy1-S1等位變異產(chǎn)生較大的長度差異(表1、圖2)。

3 討 論

黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素，影響面粉顏色和營養(yǎng)品質(zhì)。在相當(dāng)長的歷史時(shí)期，降低籽粒黃色素含量是我國小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)，這與人們青睞和推崇色澤亮白的面粉和面制品的傳統(tǒng)觀念有關(guān)。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，逐漸重視黃色素的營養(yǎng)價(jià)值，其中含有的類胡蘿卜素是合成維生素A的前體物質(zhì)，進(jìn)而育種目標(biāo)又轉(zhuǎn)為提高籽粒黃色素含量。 Psy1基因是黃色素生物合成中的關(guān)鍵基因，He等[7]在217份中國冬麥品種中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)等位變異 Psy1-A1a和 Psy1-A1b，前者占62.2%，與高黃色素含量相關(guān)，后者占37.8%，與低黃色素含量相關(guān)。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來自普通小麥的等位變異 Psy1-A1a與來自野生二粒小麥、栽培二粒小麥和斯卑爾脫小麥的 Psy1-A1k表現(xiàn)出緊密的聯(lián)系，二者僅在第四內(nèi)含子有1個(gè)SNP，顯示出 Psy1-A1a很可能是由 Psy1-A1k進(jìn)化而來。Howitt等[11]發(fā)現(xiàn)， Psy1-A1b之所以與低黃色素含量相關(guān)是由于其第二內(nèi)含子5′端的37 bp插入片段參與轉(zhuǎn)錄，發(fā)生錯(cuò)誤剪切的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本都不具有蛋白活性，只有原始類型的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生有活性的蛋白。He等[9]在硬粒小麥中鑒定的 Psy1-A1e也發(fā)現(xiàn)了同樣的37 bp插入片段，這說明此插入序列在四倍體小麥中就已經(jīng)出現(xiàn)，但在普通小麥二倍體祖先烏拉爾圖小麥中目前并未發(fā)現(xiàn)。He等[8]在217份中國冬麥品種發(fā)現(xiàn)了 Psy1-B1a、 Psy1-B1b、 Psy1-B1c和 Psy1-B1d共4個(gè)等位變異，其比例分別為39.6%、43.8%、15.7%和0.9%。其中， Psy1-B1a和 Psy1-B1c與高黃色素含量相關(guān)，而 Psy1-B1b與低黃色素含量相關(guān)。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來自普通小麥的等位變異 Psy1-B1a也在野生二粒小麥和斯卑爾脫小麥中被發(fā)現(xiàn)。在普通小麥發(fā)現(xiàn)的等位變異 Psy1-B1c與在栽培二粒小麥鑒定的等位變異 Psy1-B1m表現(xiàn)出密切的關(guān)系，兩者僅存在少數(shù)幾個(gè)SNP，顯示出 Psy1-B1c很可能是由 Psy1-B1m進(jìn)化而來。Wang等[12]在193份中國冬麥品種發(fā)現(xiàn)了2個(gè)等位變異 Psy1-D1a和 Psy1-D1g，前者占99.0%，后者占1.0%。并發(fā)現(xiàn)來自斯卑爾脫小麥的 Psy1-D1e和 Psy1-D1f以及來自粗山羊草的 Psy1-D1i與 Psy1-D1a表現(xiàn)出了極高的相似性，僅有少數(shù)幾個(gè)SNP，顯示出它們起源上的密切關(guān)系。值得注意的是， Psy1-D1g的上游序列與來自粗山羊草的 Psy1-D1b、 Psy1-D1c和 Psy1-D1d相似性非常高，尤其是在第二內(nèi)含子都含有一個(gè)172 bp片段的缺失；其下游序列則與 Psy1-D1a一致性非常高，特別是第三內(nèi)含子的一個(gè)約1.2 kb大片段的插入，這些序列上的特征進(jìn)一步的說明 Psy1-D1g很有可能是由于基因交換產(chǎn)生的新的基因類型。Ravel等[6]對(duì)372份小麥品種的研究顯示， Psy1-D1g與高黃色素含量相關(guān)。

表4 13個(gè) Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異第二內(nèi)含子的序列差異

Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異內(nèi)含子序列差異均是與 Psy1-S1a比較的結(jié)果。

SNPs and InDels in introns were exhibited between Psy1-S1a and other Psy1-B1/Psy1-S1 alleles.

(圖續(xù)轉(zhuǎn)下頁 Be continued in next page)

缺位以短橫線表示；SNP以陰影標(biāo)示；內(nèi)含子加下劃線；同義突變的密碼子及其氨基酸以黑體表示；標(biāo)記YP7B-5的上下游引物以方框標(biāo)出。

Gaps are indicated with dashes; SNPs are shadowed; Introns are underlined; Synonymous codons and amino acids are in bold type; The forward and reverse primers of the marker YP7B-5 are boxed.

圖2 13個(gè) Psy1-B1/Psy1-S1等位變異YP7B-5擴(kuò)增區(qū)域序列的比對(duì)

Fig.2 Sequence alignment of PCR region at Psy1-B1/Psy1-S1 loci amplified with YP7B-5

對(duì)于普通小麥的A基因組和D基因組的供體來源已經(jīng)明確[16-19]，分別是烏拉爾圖小麥和粗山羊草，而且這兩個(gè)基因組測序已經(jīng)完成[20-21]。對(duì)于普通小麥B基因組的起源問題，目前存在分歧的主要是具有S基因組山羊草屬的擬斯卑爾脫山羊草、高大山羊草、雙角山羊草和西爾斯山羊草。大多數(shù)研究[22-24]支持?jǐn)M斯卑爾脫山羊草是B基因組的供體或者至少是最主要的供體。Wang等[12]利用普通小麥 Psy1基因的同源引物獲得了3個(gè)擬斯卑爾脫山羊草基因全序列( Psy1-S1a、 Psy1-S1b、 Psy1-S1c)，并與來自普通小麥的 Psy1-B1d和栽培二粒小麥的 Psy1-B1k聚合在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一簇，具有很高的序列一致性，達(dá)90.1%～96.6%，而且從擬斯卑爾脫山羊草中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)等位變異 Psy1-S1a、 Psy1-S1b和 Psy1-S1c與在普通小麥的 Psy1-B1c以及栽培二粒小麥的 Psy1-B1k、 Psy1-B1m在第三內(nèi)含子有著共同的轉(zhuǎn)座子，支持?jǐn)M斯卑爾脫山羊草是B基因組的供體的結(jié)論。而本研究對(duì)高大山羊草、雙角山羊草和西爾斯山羊草的獲得的8個(gè) Psy1-S1等位變異的YP7B-5擴(kuò)增序列與Wang等[12]構(gòu)建的 Psy1等位變異系統(tǒng)發(fā)育樹中擁有B組和S組的5個(gè) Psy1-B1/Psy1-S1等位基因?qū)?yīng)部分的序列綜合分析發(fā)現(xiàn)一致性高達(dá)93.4%～98.5%，而且編碼區(qū)序列差異均為同義突變，沒有造成編碼氨基酸的變化，支持了高大山羊草、雙角山羊草和西爾斯山羊草也有可能參與B基因組演化的結(jié)論[25]。然而， Psy1基因共有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，本研究只獲得第二外顯子和第二內(nèi)含子的全部區(qū)域以及第三外顯子的絕大部分區(qū)域(93.1%)，這對(duì)研究 Psy1-S1等位基因的遺傳多樣性具有局限性。本研究應(yīng)用Wang等[12]克隆 Psy1-B1/ Psy1-S1等位變異的6對(duì)引物(P7B1、P7B3、P7B8、P7B9、P7B10和P7B11)來擴(kuò)增3套S組山羊草屬材料的 Psy1基因序列，結(jié)果都沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后根據(jù)已知的 Psy1等位變異的保守區(qū)域重新設(shè)計(jì)特異引物，只有在極為保守的第二外顯子和第三外顯子設(shè)計(jì)的特異引物YP7B-5獲得了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由此說明高大山羊草、雙角山羊草和西爾斯山羊草的 Psy1基因序列與已知的 Psy1等位基因序列存在較大的差異，加大了利用同源基因克隆技術(shù)獲得其 Psy1基因全序列的難度。經(jīng)筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，一種用來分離與已知DNA序列鄰近的未知序列的熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)為挖掘高大山羊草、雙角山羊草和西爾斯山羊草的 Psy1基因全序列提供了可行的途徑[26]，這將對(duì)深入研究 Psy1-B1/Psy1-S1等位基因的遺傳多樣性以及解析普通小麥B基因組起源都具有重要意義。

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Cloning and Sequence Analysis of Phytoene Synthase 1 ( Psy1) Gene Fragment inAegilopsSpecies of S Genome

WANG Jianwu1,3,HE Xinyao2,4,WANG Hui3,XIA Xianchun2,HE Zhonghu2,5

(1.College of Agronomy,Yangtze University,Jingzhou,Hubei 434025,China; 2.Institute of Crop Science/National Wheat Improvement Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China; 3.College of Agronomy, Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 4.International Maize and Wheat Improvement Center, Texcoco CP 56237,Mexico; 5.CIMMYT-China Office,Beijing 100081,China)

Carotenoids content(YPC) is the main factor influencing wheat flour color. The phytoene synthase 1( Psy1) gene encodes a key enzyme to determine the carotenoids content of endosperm in wheat.Aegilopsspecies are important resources for wheat genetic improvement. In the present study,threeAegilopsspecies includingAe.longissima(SS),Ae.bicornis(SS) andAe.searsii(SS) were used to clone Psy1 genes in order to disclose their genetic diversity. Using homologous gene cloning approach,the partial Psy1 gene sequences of eight novel allelic variants at Psy1-S1 locus were obtained by the marker YP7B-5,covering the whole region of the second exon and the second intron and the 93.1% region of the third exon. High sequence similarity of 93.4% to 98.5% was shown between these eight Psy1-S1 alleles and other five Psy1-B1/ Psy1-S1 alleles,including Psy1-B1d from common wheat, Psy1-B1k fromT.dicoccumand Psy1-S1a, Psy1-S1b, Psy1-S1c fromAe.speltoides. Moreover,they showed higher similarity in the coding sequences with only a few synonymous SNPs. There were several SNPs and InDels in the second intron,which make a valuable contribution to the genetic diversity of the Psy1 gene,particularly a 163 bp insertion from Psy1-S1h and a 177 bp deletion from Psy1-S1i,which were mainly attributed to the length difference,compared with other Psy1-B1/ Psy1-S1 alleles.

Yellow pigment of wheat grain;Aegilops; Phytoene synthase 1 gene( Psy1); Cloning of gene fragment

時(shí)間：2017-04-07

2016-12-12

2017-03-15 基金項(xiàng)目：長江大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(118/801180010115) 第一作者E-mail：wjw19802013@163.com 通訊作者：何中虎(E-mail:zhhecaas@163.com)；夏先春(E-mail:xiaxianchun@caas.cn)

S512.9；S336

A

1009-1041(2017)04-0429-09

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