響應(yīng)面法優(yōu)化大豆11S蛋白谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性工藝參數(shù)

李風(fēng)光,李軍生，閻柳娟，黃國霞

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006； 2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006； 3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

油料蛋白

響應(yīng)面法優(yōu)化大豆11S蛋白谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性工藝參數(shù)

李風(fēng)光1,2,3,李軍生1,2,3，閻柳娟1,2,3，黃國霞1,2,3

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006； 2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006； 3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶交聯(lián)反應(yīng)條件，制備高乳化性大豆11S蛋白。以酶添加量(以50 mL樣液為參照)、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度、溫度和pH為自變量，以乳化性為響應(yīng)值，利用單因素實驗和響應(yīng)面法對高乳化性大豆11S蛋白制備條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件為酶添加量22 U(50 mL大豆11S蛋白溶液)、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度26.5 g/L、溫度47℃、時間2 h、pH 8.0。在最佳反應(yīng)條件下，乳化性為76.13%，模型的預(yù)測值為76.89%，實驗值與預(yù)測值相差0.76個百分點，擬合模型具有良好可靠性。未改性大豆11S蛋白乳化性為60.00%，改性后其乳化性提高16.13個百分點。

響應(yīng)面法；大豆11S蛋白；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；酶交聯(lián)改性

大豆中含有蛋白質(zhì)約40%[1]，由脫脂大豆粉經(jīng)過堿溶酸沉等方法可制備大豆分離蛋白(SPI)[2]。采用等電點高速離心法可將大豆分離蛋白分離成2S、7S、11S、15S(S為沉降系數(shù))4種球蛋白組分[3]，其中2S和15S組分約13%，而7S組分約35%，11S組分約52%[4]。大豆分離蛋白中含有18種常見氨基酸[5]，營養(yǎng)價值相當(dāng)高，經(jīng)過進一步的提純后可直接作為一種食品。由于球蛋白在穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)的過程中將疏水性基團包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，從而使得大豆分離蛋白的乳化性等受到限制[6]。大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量高達93.1%[5]，乳化性能較差。大豆11S蛋白作為大豆分離蛋白中主要組分，使得對其進行改性修飾具有很大的空間。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種能夠促使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)?；l(fā)生轉(zhuǎn)移的生物酶，能使賴氨酸殘基和谷氨酸殘基間形成ε-(γ-谷氨酰) 賴氨酸共價鍵[7]，該鍵的形成能促使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的肽鏈間發(fā)生交聯(lián)，生成具有優(yōu)良凝膠性能的網(wǎng)絡(luò)狀超大蛋白質(zhì)分子，有效提高蛋白質(zhì)的起泡性、乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)，進而改善食品蛋白質(zhì)的質(zhì)構(gòu)、外觀和風(fēng)味，被譽為“2l世紀(jì)超級黏合劑”，是一種在食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛的酶制劑[8]。楊春華[9]通過對高去酰胺堿性蛋白酶與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶復(fù)合改性大豆11S球蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，改性后的11S球蛋白乳化性提高了11.3%。楊淼等[10]研究不同油相比例的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白乳液凝膠性能的誘導(dǎo)影響，得出提高油相比例時凝膠的持水性有顯著提高。從而說明谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能在一定程度上提高大豆分離蛋白的乳化性能。

本實驗采用響應(yīng)面法對酶交聯(lián)改性反應(yīng)條件進行優(yōu)化，分析酶添加量、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度、pH、溫度4個因素對響應(yīng)值乳化性影響的變化規(guī)律，確定酶交聯(lián)改性制備高乳化性大豆11S蛋白的最佳工藝參數(shù)，為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脫脂大豆粕，購自安陽得天力食品有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(40 U/g)，購自南寧龐博生物工程有限公司；金龍魚大豆調(diào)和油，購于譚中超市；其他試劑均為分析純。

JJ200電子天平，PHS-250W pH計，J-26XPI Bechman Coulter高速冷凍離心機，YFD2000中型冷凍干燥機，DHG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機，HZ-9201K臺式恒溫振蕩器，DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，100LX 高剪切混合乳化機。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆11S蛋白的制備

采用Samoto等[5]方法稍作修改。稱取5 000 g脫脂大豆粉(低脂大豆粕粉碎過60目篩，70℃干熱處理2 h)，配成料液比1∶10的樣品溶液。用2 mol/L NaOH溶液調(diào)整溶液pH至8.0，25℃條件下攪拌2 h。在15℃、5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，上清液中加入1 mol/L的Na2SO3溶液5 mL使上清液中Na2SO3濃度約為1 mmol/L,再用2 mol/L HCl溶液調(diào)整pH至5.8，在15℃、5 000 r/min條件下離心10 min，所得沉淀即為大豆11S蛋白，沉淀冷凍干燥備用。

1.2.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化大豆11S蛋白交聯(lián)工藝流程

大豆11S蛋白→ 0.2 mol/L磷酸緩沖液溶解→加酶→200次/min振蕩反應(yīng)→ 85℃滅酶→改性大豆11S蛋白。

1.2.3 改性大豆11S蛋白乳化性測定

取5 mL樣液于25 mL蒸餾水和20 mL大豆油混合液中，在10 000 r/min條件下乳化1 min，將乳化液倒入乳化管中，靜置60 min后觀察乳化層高度。乳化性計算公式為[11]：

乳化性=乳化層高度/液體總高度×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆11S蛋白改性單因素實驗

2.1.1 酶添加量對大豆11S蛋白乳化性的影響

利用 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)配制25 g/L 大豆11S蛋白溶液50 mL，分別添加 0、12、16、20、24、28 U谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，反應(yīng)混合物于 50℃下反應(yīng) 2 h，反應(yīng)后 85℃滅活 15 min。測定乳化性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶添加量對大豆11S蛋白乳化性的影響

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，乳化性逐漸提升，當(dāng)酶添加量為20 U時，乳化性達到最大值74.04%，酶添加量大于20 U時乳化性有所下降。因此，實驗將酶添加量的考察范圍定為16～24 U。

2.1.2 大豆11S蛋白質(zhì)量濃度對大豆11S蛋白乳化性的影響

利用0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)分別配制0、15、20、25、30、35 g/L的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量為20 U，反應(yīng)混合物于 50℃下反應(yīng) 2 h，反應(yīng)后85℃滅活15 min。測定乳化性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 大豆11S蛋白質(zhì)量濃度對大豆11S

由圖2可以看出，隨著大豆11S蛋白質(zhì)量濃度的增加，乳化性逐漸提升，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 g/L時乳化性達到最大值74.51%，當(dāng)質(zhì)量濃度超過25 g/L時乳化性有所下降。因此，實驗將大豆11S蛋白質(zhì)量濃度的考察范圍定為20～30 g/L。

2.1.3 溫度對大豆11S蛋白乳化性的影響

利用 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)配制25 g/L 的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量為 20 U，反應(yīng)混合物于溫度40、45、50、55、60℃下反應(yīng)2 h，反應(yīng)后 85℃滅活 15 min。測定乳化性，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對大豆11S蛋白乳化性的影響

由圖3可以看出，隨著溫度的升高乳化性不斷增加，當(dāng)溫度達到45℃時乳化性達到最大值75.92%，當(dāng)溫度超過45℃時乳化性有較明顯的下降趨勢。因此，實驗將溫度的考察范圍定為40～50℃。

2.1.4 pH對大豆11S蛋白乳化性的影響

利用pH 分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液配制25 g/L的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量為 20 U，反應(yīng)混合物于50℃下反應(yīng) 2 h，反應(yīng)后 85℃滅活 15 min。測定乳化性，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對大豆11S蛋白乳化性的影響

由圖4可以看出，隨著pH的增加乳化性呈上升趨勢，當(dāng)pH為7.5時乳化性達到最大值77.36%，pH超過7.5后乳化性有所下降。但pH為8.0時乳化性高于pH 7.0之前的乳化性。因此，實驗將pH的考察范圍定為7.0～8.0。

2.2 大豆11S蛋白改性響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，固定時間為2 h，確定酶添加量(A)(以50 mL樣液為參照)、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度(B)、溫度(C)、pH(D)4個因素水平，以乳化性(Y)為響應(yīng)值，依照Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理[12-15]，采用四因素三水平響應(yīng)面進行實驗。每組實驗重復(fù)3次，取其平均值為實驗結(jié)果。響應(yīng)面因素及水平見表1，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素及水平

表2 實驗設(shè)計方案及結(jié)果

續(xù)表2

實驗號ABCDY/%140-10-169.00150-10175.0016000074.0417011064.7118000074.5119-100-168.3720001166.0021000074.5322-1-10071.0023-110072.0024010175.9625110072.6426000074.762710-1071.1528100176.4729-10-1071.15

2.2.2 響應(yīng)面二次回歸模型建立及分析

利用Design-Expert V8.0.5.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，以乳化性為響應(yīng)值，得到模擬方程如下：

Y=-131.756 71+0.444 69A+0.063 167B+

5.429 5C+17.633D-0.001 125AB+0.001 312AC+0.010 937AD+0.006 95BC+0.033 25BD-0.012 75CD-0.013 013A2-0.011 853B2-0.058 828C2-1.062 83D2

對上述模型有效性進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3還可以看出，C、D、A2、B2、C2、D2對Y值的影響極顯著(P<0.01)，BC影響顯著(P<0.05)，其他因素影響不顯著。通過比較各變量P值可知，各因素對改性大豆11S蛋白乳化性的影響從大到小排序為溫度>pH>酶添加量>大豆11S蛋白質(zhì)量濃度。

由響應(yīng)面分析可知，回歸模型存在最大值點編碼值(-0.000、0.423、-0.045、1.000)，最大值點對應(yīng)的模型各因素反應(yīng)條件為酶添加量21.66 U、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度26.65 g/L、溫度47.09℃、pH 8.0，在該條件下響應(yīng)面預(yù)測的乳化性為76.89%。

表3 回歸模型方差分析

注：**為極顯著,P<0.01；*為顯著，P<0.05。

2.3 最佳條件下的驗證實驗

為了驗證模型的可靠性，對響應(yīng)面優(yōu)化條件進行驗證實驗，考慮到實際實驗操作的可行性，將最佳條件優(yōu)化為酶添加量22 U(以50 mL樣液為參照)、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度26.5 g/L、溫度47℃、pH 8.0、時間2 h。同時對比測定改性前后大豆11S蛋白的乳化性，結(jié)果見表4。

表4 改性前后大豆11S蛋白的乳化性對比測定結(jié)果

由表4可以看出，改性前大豆11S蛋白的乳化性平均值為60.00%，改性后其乳化性平均值為76.13%，模型預(yù)測值為76.89%，乳化性比改性前的提高16.13個百分點，同時與預(yù)測值相差0.76個百分點。驗證實驗表明，該模型較好地預(yù)測了改性大豆11S蛋白制備過程中乳化性的情況，且谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性處理后大豆11S蛋白的乳化性有很大程度的提高。

3 結(jié) 論

利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對大豆11S蛋白進行酶交聯(lián)改性，以乳化性為響應(yīng)值，通過四因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面法，建立了乳化性的二次多項式回歸模型方程?；貧w方程擬合效果較好，可以利用該方程預(yù)測谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對大豆11S蛋白進行改性后的乳化性。

通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗所得最佳工藝條件為酶添加量22 U(以50 mL樣液為參照)、大豆11S蛋白質(zhì)量濃度26.5 g/L、溫度47℃、時間2 h、pH 8.0。在最佳條件下，乳化性的預(yù)測值為76.89%，實際測定值為76.13%，二者相差0.76個百分點，預(yù)測值與實際值擬合性良好。未改性大豆11S蛋白乳化性測定值為60.00%，改性后其乳化性提高16.13個百分點。

[1] 遲玉森.新編大豆食品加工原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2014.

[2] 沈再春,沈群,費曉書,等.國內(nèi)大豆分離蛋白生產(chǎn)現(xiàn)狀、差距及建議[J].糧食與飼料工業(yè),1998(3):35-37.

[3] 田琨,管娟,邵正中,等.大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)與性能[J].化學(xué)進展, 2008, 20(4): 565-567.

[4] KINSELL J E.Functional properties of soy proteins[J].J Am Oil Chem Soc,1979,56(3):242-258.

[5] SAMOTO M, MAEBUCHI M,MIYAZAKI C,et al.Abundant proteins associated with lecithin in soy protein isolate[J].Food Chem,2007,102(1):317-322.

[6] 張楚富.生物化學(xué)原理[M].北京:高等教育出版社,2003.

[7] 江波.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的性質(zhì)及在食品中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2001(4):34-36.

[8] 孫寶國.食品添加劑[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2015.

[9] 楊春華.高去酰胺堿性蛋白酶與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶復(fù)合改性大豆11S球蛋白[D].哈爾濱:哈爾濱商業(yè)大學(xué),2011.

[10] 楊淼，唐傳核.微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白乳液凝膠性能的影響[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(1):5-8.

[11] 李麗娜.蛋白質(zhì)基表面活性劑的制備與性能研究[D].南寧:廣西大學(xué),2009.

[12] 王淑霞,李愛梅,張俊杰.響應(yīng)面分析法優(yōu)化龍眼核中多酚物質(zhì)提取工藝[J].食品科學(xué),2011(10):35-39.

[13] 鞠興榮,稅丹,何榮,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化菜籽多糖酸法提取工藝的研究[J].中國糧油學(xué)報,2012,27(3):89-93.

[14] 任嬌艷,趙謀明,崔春,等.基于響應(yīng)面分析法的草魚蛋白酶解工藝[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,34(3):95-100.

[15] SATPH S,APINES M J, TSUKIOKA T, et al.Bioavailability of amino acid-chenlate and glassembedded manganese to rainbow trout,Oncorhynchusmykiss(Walbaum),fingerlings[J].Aquac Res, 2002,32(s1):18-25.

Optimization of modification process parameters of soybean 11S protein by glutamine transaminase using response surface methodology

LI Fengguang1,2,3, LI Junsheng1,2,3, YAN Liujuan1,2,3, HUANG Guoxia1,2,3

(1.Faculty of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Liuzhou 545006,Guangxi,China; 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes,Liuzhou 545006,Guangxi,China)

Enzyme crosslinking reaction conditions were optimized by response surface methodology to prepare high emulsibility soybean 11S protein.With dosage of enzyme(50 mL sample solution as reference), mass concentration of soybean 11S protein, temperature and pH as independent variables, and emulsibility as response value,the preparation conditions were optimized by single factor experiment and response surface methodology. The results showed that the optimal preparation conditions were obtained as follows: dosage of enzyme 22 U(50 mL soybean 11S protein solution), mass concentration of soybean 11S protein 26.5 g/L, temperature 47℃, time 2 h, and pH 8.0.Under the optimal conditions,the emulsibility was 76.13%, the model predictive value was 76.89%, and the error between experimental value and predictive value was 0.76 percentage points, which showed a good reliability of fitting model. The emulsibility of modified protein increased by 16.13 percentage points compared with unmodified soybean 11S protein with emulsibility 60.00%.

response surface methodology；soybean 11S protein；glutamine transaminase；enzyme crosslinking modification

2016-06-01;

2016-10-14

國家自然科學(xué)基金項目(21466006)；國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目(14C26214502814)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科能1412009-3-3，桂科轉(zhuǎn)14125006-30)；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團隊及卓越學(xué)者計劃資助(桂教人(2014)7號)

李風(fēng)光(1989)，男，碩士研究生，研究方向為生物分子化學(xué)修飾(E-mail)m13788325731_2@163.com。

李軍生，教授，碩士生導(dǎo)師(E-mail)junshenglee63@aliyun.com。

TQ936.2;Q51

A

1003-7969(2017)02-0093-05