不同反應(yīng)溫度下T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應(yīng)動力學(xué)研究

覃小麗, 王永華,鐘金鋒

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣州 510640)

油脂化學(xué)

不同反應(yīng)溫度下T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應(yīng)動力學(xué)研究

覃小麗1, 王永華2,鐘金鋒1

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣州 510640)

T1脂肪酶是一種新型耐熱脂肪酶，能催化油酸與甘油的酯化反應(yīng)。當(dāng)甘油與油酸物質(zhì)的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占總反應(yīng)物質(zhì)量)、緩沖液的添加量5%(占總反應(yīng)物質(zhì)量)和轉(zhuǎn)速542 r/min時，考察不同反應(yīng)溫度(40、50、60℃)下T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應(yīng)的動力學(xué)。結(jié)果表明，T1脂肪酶催化該酯化反應(yīng)活化能為20.272 9 kJ/mol；當(dāng)反應(yīng)溫度較低(40℃)時遵循準一級反應(yīng)；隨著反應(yīng)溫度升高到較高范圍(50、60℃)，則變?yōu)闇识壏磻?yīng)。

T1 脂肪酶；甘油；油酸；酯化反應(yīng)；動力學(xué)

T1脂肪酶來源于Geobacillussp.，是一種新型脂肪酶，在較高的反應(yīng)溫度(60℃)下仍保持較高的酶活性和廣泛的底物特異性與選擇性[1-2]。近年來，對T1脂肪酶的研究主要集中在表達、分離純化和酶學(xué)性質(zhì)[2-5]等方面，而對T1脂肪酶應(yīng)用于油脂改性的研究相對較少[6-8]。前期研究[6]顯示，盡管T1脂肪酶對長鏈脂肪酸(硬脂酸、油酸)的選擇性較差，但是其催化油酸與甘油的酯化反應(yīng)在2 h內(nèi)達到80%左右的酯化率，顯示了其作為生物催化劑在油脂領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用。此外，我們前期從各反應(yīng)因素(水添加量、反應(yīng)溫度、甘油和油酸物質(zhì)的量比)對酯化率的影響出發(fā)，假設(shè)其遵循改進的一級反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果表明模型計算值與實驗值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(R2=0.996)[9]。但是，該研究僅討論了各反應(yīng)因素對半經(jīng)驗的動力學(xué)方程系數(shù)的影響，對反應(yīng)溫度與從反應(yīng)機理推導(dǎo)的動力學(xué)方程的關(guān)系還缺乏深入研究，尤其是T1脂肪酶催化甘油與油酸酯化過程的動力學(xué)及其活化能尚未見報道，不利于后續(xù)工藝的優(yōu)化。因此，本文將進一步探索反應(yīng)溫度對T1脂肪酶催化油酸與甘油的酯化反應(yīng)的影響，從反應(yīng)機理角度研究T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應(yīng)的動力學(xué)并建立動力學(xué)模型，以期為T1脂肪酶應(yīng)用于油脂改性工藝設(shè)計提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

甘油酯標(biāo)準品(單油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)， Sigma-Aldrich公司；油酸(>70%，分析純)，上海精純試劑有限公司；T1脂肪酶(粗酶，含纖維素結(jié)合域)， 實驗室自制[6]；甘油、正己烷和異丙醇為色譜純，天津科密歐藥品公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；Waters 1525型高效液相色譜儀、Waters 2414型示差折光檢測器，Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 T1脂肪酶催化酯化反應(yīng)

將甘油與油酸(物質(zhì)的量比2∶1，油酸4.3 g)添加到25 mL具塞錐形瓶中，隨后加入占總反應(yīng)物質(zhì)量5%的緩沖液(0.05 mol/L Tris-HCl, pH 9.0)，充分混勻后在反應(yīng)溫度下預(yù)熱后加入9.7 U/g 的T1脂肪酶，置于一定溫度的磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速542 r/min)中反應(yīng)。考察反應(yīng)溫度(40～70℃)對酶促酯化反應(yīng)的影響。在反應(yīng)過程中定時(0、1、2、3、6、9、12 h)取樣，樣品經(jīng)離心(6 950×g，10 min)后，上層(油相)用于HPLC分析。實驗結(jié)果以2次測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。

1.2.2 酯化產(chǎn)物的HPLC分析

樣品處理：取20 μL油相(見1.2.1)于1.5 mL色譜瓶中，用1 mL流動相溶解并充分混勻，待HPLC分析。

HPLC對產(chǎn)物分析的主要條件：Phenomenex Luna Silica色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35℃；流動相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比15∶1∶0.003)；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。通過對比標(biāo)準樣品的保留時間對酶促酯化反應(yīng)中各組分進行定性；各出峰組分(油酸、單油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)相對含量通過面積歸一化法進行定量。油酸酯化率(FA)按公式(1)計算：

(1)

式中：F0為反應(yīng)初始時油酸的相對含量，%；Ft為反應(yīng)一段時間后混合物中油酸的相對含量，%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用MicrosoftExcel2010對油酸與甘油在T1脂肪酶作用下的酯化率數(shù)據(jù)進行處理；以油酸的酯化率為指標(biāo)進行反應(yīng)過程分析，采用最小二乘法(Solver,MicrosoftExcel2010)進行擬合得到酯化反應(yīng)動力學(xué)方程模型的參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 動力學(xué)模型的建立

在T1脂肪酶的催化作用下，油酸與甘油的酯化反應(yīng)可由下面的反應(yīng)式表述。該酯化反應(yīng)的反應(yīng)速率可由公式(2)表示。

(2)

式中：rA為油酸的反應(yīng)速率；ke為酯化反應(yīng)的速率常數(shù)；CA為反應(yīng)物油酸(A)的濃度；CB為反應(yīng)物甘油(B)的濃度；α、β為反應(yīng)級數(shù)。

(3)

假設(shè)在油酸與甘油酯化反應(yīng)過程中油酸的酯化率為FA，反應(yīng)體系中油酸的初始濃度為CA0，則在反應(yīng)的任意時刻，油酸的濃度(CA)可用公式(4)表示。

(4)

(5)

公式(4)與公式(5)合并得到

(6)

(7)

2.2 T1脂肪酶催化油酸與甘油的酯化反應(yīng)動力學(xué)方程參數(shù)的確定

圖1為不同反應(yīng)溫度下油酸酯化率與反應(yīng)時間的關(guān)系。從圖1中可看出，在甘油與油酸物質(zhì)的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占總反應(yīng)物質(zhì)量)、緩沖液的添加量5%(占總反應(yīng)物質(zhì)量)和轉(zhuǎn)速542 r/min 情況下，油酸酯化率隨著反應(yīng)溫度的升高而呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時，在考察的反應(yīng)時間范圍內(nèi)油酸酯化率最高；而當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到70℃時，油酸酯化率急劇降低，酯化率小于11.5%，這主要由于T1脂肪酶在此反應(yīng)溫度下蛋白質(zhì)發(fā)生變性，酶活力嚴重損失。因此，不考慮反應(yīng)溫度在70℃時對該酯化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的影響。

圖1 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度40～60℃范圍內(nèi)，油酸酯化率與反應(yīng)時間呈現(xiàn)一定的非線性關(guān)系[9](見圖1)。以O(shè)rigin 8.0軟件作圖(反應(yīng)時間t為橫坐標(biāo)，油酸酯化率FA為縱坐標(biāo))，選用非線性方程(FA=a0-a1e-a2t)對數(shù)據(jù)進行擬合，得到該方程的各個系數(shù)(a0、a1、a2)，結(jié)果見表1。由表1可知，相關(guān)系數(shù)R2均在0.95以上，說明該非線性方程能較好表述不同反應(yīng)溫度下油酸酯化率與反應(yīng)時間的關(guān)系。

表1 不同反應(yīng)溫度下油酸酯化率與反應(yīng)時間擬合結(jié)果

(8)

根據(jù)擬合方程可以得到在不同反應(yīng)溫度的參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下的反應(yīng)級數(shù)和反應(yīng)速率常數(shù)

由表2可知，該酯化反應(yīng)在較低溫度(40℃)時呈現(xiàn)準一級反應(yīng)；在較高溫度(50、60℃)時則呈現(xiàn)準二級反應(yīng)。

2.3 T1脂肪酶催化油酸與甘油酯化反應(yīng)的活化能

(9)

圖2 lnk與1/T的關(guān)系

3 結(jié) 論

[1] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. A thermoalkaliphilic lipase ofGeobacillussp. T1 [J]. Extremophiles, 2007, 11(3): 527-535.

[2] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. High level expression of thermostable lipase fromGeobacillussp. strain T1 [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(1): 96-103.

[3] RAHMAN R N Z R A, LEOW T C, BASRI M, et al. Secretory expression of thermostable T1 lipase through bacteriocin release protein [J]. Protein Expr Purif, 2005, 40(2): 411-416.

[4] WANG Y, WEI D Q, WANG J F. Molecular dynamics studies on T1 lipase: insight into a double-flap mechanism [J]. J Chem Inf Model, 2010, 50(5): 875-878.

[5] HAGIWARA Y, MATSUMURA H, TATENO M. Functional roles of a structural element involving Na+-π interactions in the catalytic site of T1 lipase revealed by molecular dynamics simulations [J]. J Am Oil Chem Soc, 2009, 131(46): 16697-16705.

[6] QIN X L, LAN D M, ZHONG J F, et al. Fatty acid specificity of T1 lipase and its potential in acylglycerol synthesis [J]. J Sci Food Agric, 2014, 94(8): 1614-1621.

[7] QIN X L, HUANG H H, LAN D M, et al. Typoselectivity of crudeGeobacillussp. T1 lipase fused with a cellulose-binding domain and its use in the synthesis of structured lipids [J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(1): 55-62.

[8] XU Y, GUO S H, WANG W F, et al. Enzymatic hydrolysis of palm stearin to produce diacylglycerol with a highly thermostable lipase [J]. Eur J Lipid Sci Technol, 2013, 115(5): 564-570.

[9] 鐘金鋒, 覃小麗, 王永華. T1 脂肪酶催化合成甘油酯過程酯化率變化規(guī)律研究 [J]. 中國糧油學(xué)報, 2014, 29(12): 60-64.

Kinetics on T1 lipase-catalyzed esterification of oleic acid and glycerol at different temperatures

QIN Xiaoli1,WANG Yonghua2, ZHONG Jinfeng1

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

T1 lipase was a kind new thermostable lipase and it could catalyze esterification of oleic acid and glycerol. Under the conditions of molar ratio of glycerol to oleic acid 2∶1, dosage of enzyme 9.7 U/g(based on total mass of reactants) , dosage of Tris-HCl buffer 5%(based on total mass of reactants) and stirring speed 542 r/min, the kinetics of esterification of oleic acid and glycerol catalyzed with T1 lipase at different temperatures were inveastigated. The results showed that the activation energy was 20.272 9 kJ/mol. The kinetic model was pseudo-first order reaction when reaction temperature was lower (40℃), but it became pseudo-second order reaction when the reaction temperature increased to 50℃ and 60℃.

T1 lipase; glycerol; oleic acid; esterification; kinetics

2016-07-21；

2016-11-30

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(cstc2015jcyjA80013)；國家自然科學(xué)基金(31501446；31601430)；中國博士后科學(xué)基金(2016M602636)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(XDJK2016B034)

覃小麗(1984)，女，講師，博士，研究方向為油脂的生物酶法改性(E-mail)qinxl@swu.edu.cn。

鐘金鋒，副教授，博士(E-mail)jinfzhong@163.com。

TQ641;Q555

A

1003-7969(2017)02-0034-04