脂多糖/脂多糖結合蛋白復合物的初步構建

鄭珍容 賀斌峰 魏征華 王關嵩 戢福云 徐智

?

·論著·

脂多糖/脂多糖結合蛋白復合物的初步構建

鄭珍容 賀斌峰 魏征華 王關嵩 戢福云 徐智

目的采用溫孵法構建脂多糖/脂多糖結合蛋白(LPS/LBP)復合物，研究LPS炎癥信號通路。方法將LPS與LBP按 15︰1、10︰1、5︰1的比例混勻。把LPS/LBP混合物、LBP(濃度分別為200 μg/ml、100 μg/ml和50 μg/ml)、LPS(濃度分別為100 μg/ml、50 μg/ml)過夜孵育。將孵育后的LPS/LBP混合物、LBP、LPS行凝膠電泳，經考馬斯亮藍染色后將各染色條帶切取，行蛋白回收，并測定內毒素。結果凝膠電泳后，LPS/LBP復合物、LBP泳道于相對分子質量52×103處可見考馬斯亮蘭染色的條帶。樣本中LBP濃度越高、條帶染色越濃，LPS泳道對應于相對分子質量52×103處無染色條帶出現。各濃度比例的LPS/LBP復合物電泳后凝膠條帶回收物中均能檢測出內毒素。10︰1 LPS/LBP復合物組、15︰1 LPS/LBP復合物組復合物內毒素濃度顯著高于5︰1 LPS/LBP復合物組內毒素濃度(P<0.05)。10︰1 LPS/LBP復合物組與15︰1 LPS/LBP復合物組內毒素濃度無統(tǒng)計學差異(P>0.1)。各濃度LBP組均未檢出內毒素，各LPS組內毒素檢測也為陰性。 結論LPS︰LBP為10︰1是較為合理的構建LPS/LBP復合物的比例，通過溫孵及凝膠電泳可獲得純度較高的LPS/LBP復合物。

脂多糖； 脂多糖結合蛋白； 復合物； 構建

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又稱為內毒素，是革蘭陰性細菌外壁的主要成分,是內毒素性急性肺損傷(acute lung injury, ALI)主要致病因素之一,可致內毒素性急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1-3]。脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)是一種相對分子質量為60×103的糖蛋白,其蛋白質部分由一條相對分子質量5×103的單鏈多肽組成。LBP分子具有氨基(N)末端區(qū)域和羧基(C)末端區(qū)域。LPS致炎效應的增強需要有LBP的參與，LBP可以將LPS解聚為單體，單體形式的LPS在LBP的N末端參與下，將LPS遞呈給位于單核巨噬細胞及中性粒細胞表面的受體CD14從而啟動LPS炎癥信號通路,誘發(fā)級聯式炎癥反應瀑布,導致ALI[4-8]。其中LPS/LBP/CD14三聚復合物形成后可以明顯放大炎癥反應，LBP/CD14系統(tǒng)在這一過程中起重要作用，所以又被稱為內毒素增敏系統(tǒng)。當機體發(fā)生內毒素血癥時，CD14主要與LPS/LBP復合物結合而啟動炎癥信號通路。因此，目前對CD14與LPS致炎作用相關的功能域的認識存在一定誤區(qū)，即割裂看待LPS、LBP、CD14結合的問題。實際上，無論是CD14與LPS結合的功能域，還是CD14與LBP結合的功能域，均不能反映CD14與LPS致炎作用相關的實際功能域。目前針對CD14/LPS結合功能域或CD14/LBP結合功能域開發(fā)的各種拮抗劑均未能取得良好的臨床抗內毒素作用也從一定程度上證實了這一問題。由此，推測CD14一定存在特異區(qū)域與LPS/LBP復合物結合的功能域，而這一功能域才是決定LPS啟動致炎信號通路的關鍵點。尋找LPS/LBP復合物與CD14的結合位點，篩選該位點的抑制劑，有可能早期阻斷LPS炎癥信號通路。本實驗構建LPS/LBP復合物，以期為內毒素性急性呼吸窘迫綜合征提供防治策略。

材料與方法

一、實驗材料

Rh LBP(sigma公司，美國)，LPS(sigma公司，美國)，蛋白marker(Thermo公司，美國)，其他試劑均為國產分析純。電泳儀(BIO-RAD，美國)，凝膠顯像儀(BIO-RAD ChemiDoc MP Imaging System，美國)，純水儀(Millipore公司，美國)，恒溫水浴箱(上海一恒公司),垂直電泳槽 (BIO-RAD，美國),內毒素檢測設備(動態(tài)試管儀，LKL-164-03，英國)。

二、實驗方法

1. 實驗分組：實驗共分為8組：15︰1 LPS/LBP復合物組(LPS︰LBP=3 000 μug/ml︰200 μg/ml)、10︰1 LPS/LBP復合物組(LPS︰LBP=1 000 μg/ml︰100 μg/ml)、5︰1 LPS/LBP復合物組(LPS︰LBP=250 μg/ml︰50 μg/ml)、200 μg/ml LBP組、100 μg/ml LBP組、50 μg/ml LBP組、100 μg/ml LPS組、50 μg/ml LPS組。

2. 復合物的孵育： 將LPS與LBP按3 000 μg/ml︰200 μg/ml、1 000 μg/ml︰100 μg/ml、250 μg/ml︰50 μg/ml的比例混勻。隨后將LPS/LBP復合物、100 μg/ml LBP、100 μg/ml LPS置于恒溫水浴搖床過夜孵育，170 r/min，孵育溫度37 ℃，孵育時間為10 h。

3. 凝膠電泳及考馬斯亮藍染色與凝膠顯像： 自來水清洗玻璃板，并室溫晾干，將厚薄兩塊膠板對齊后裝入制膠架上，配制10%分離膠及5%濃縮膠，注入分離膠及濃縮膠，將新鮮1×蛋白電泳緩沖液加入電泳裝置的內槽至少漫過內側矮玻璃板，外槽中倒入加入1×蛋白電泳緩沖液至所需的刻度指示處，按樣品與緩沖液比例4︰1向各樣品中加入上樣緩沖液并混勻，用50 μl微量加樣器加入樣品，加樣順序為LPS/LBP復合物、LBP、LPS,加樣體積均為20 μl，蛋白Marker點樣孔加3 μl。正確接通正負電極，開通電源，選擇110 V恒壓下進行電泳1～1.5 h，直至Maker條帶完全跑開，最小分子量條帶遷移至分離膠下緣時停止電泳，取出電泳后的聚丙烯酰胺凝膠，用蒸餾水沖洗凝膠，考馬斯亮藍染色30 min，將膠放入另一個干凈的器皿中用雙蒸水沖洗膠，再加入20 ml一倍的脫色液，置于搖床上，震蕩清洗15 min，重復3次。清洗后，進行蛋白條帶的觀察并將凝膠置于凝膠顯像儀上顯像。

4. 條帶內容物回收： 顯像后切取凝膠上的LPS/LBP復合物條帶、LBP條帶、LPS條帶，用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收LPS/LBP復合物、LBP和LPS凝膠條帶。參照PAGE膠蛋白回收試劑盒說明書回收各條帶內容物。

5. 內毒素測定： 用二喹啉甲酸法(bicinchonininc acid, BCA)檢測各組回收物的蛋白濃度，并將其調成一致(LPS組不含蛋白，不進行蛋白濃度調整)，送第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院內毒素檢測中心進行測定。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、LPS/LBP復合物與LBP、LPS電泳

經凝膠顯像儀顯像，LPS/LBP復合物、LBP泳道于相對分子質量52×103處可見考馬斯亮蘭染色的條帶。樣本中LBP濃度越高、條帶染色越濃。而LPS泳道對應于相對分子質量52×103處無染色條帶出現，這與樣本中不含蛋白質有關，見圖1。

圖1 LPS/LBP復合物、LBP和LPS的凝膠顯像結果；注：泳道1：3 000 μg/ml︰200 μg/ml LPS/LBP；泳道2：1 000 μg/ml︰100 μg/ml LPS/LBP；泳道3：250 μg/ml︰50 μg/ml LPS/LBP；泳道4：200 μg/ml LBP；泳道5：100 μg/ml LBP；泳道6：50 μg/ml LBP；泳道7：200 μg/ml LPS；泳道8：100 μg/ml LPS

二、凝膠回收物內毒素測定

各濃度比例的LPS/LBP復合物電泳后凝膠條帶回收物中均能檢測出內毒素。10︰1 LPS/LBP復合物組、15︰1 LPS/LBP復合物組復合物內毒素濃度顯著高于5︰1 LPS/LBP復合物組內毒素濃度(P<0.05)。10︰1 LPS/LBP復合物組與15︰1 LPS/LBP復合物組內毒素濃度無統(tǒng)計學差異(P>0.1)。各濃度LBP組均未檢出內毒素，LPS組內毒素檢測也為陰性，見表1，圖2。

表1 LPS/LBP復合物組凝膠回收物內毒素水平

注：aP<0.05，與5︰1LPS/LBP組比較

圖2 各實驗組凝膠回收物內毒素水平；aP<0.05，與5︰1LPS/LBP組比較；各LBP組、LPS組內毒素測定均為陰性

討 論

內毒素是革蘭陰性菌細胞壁中的LPS組分，LPS的主要毒力部分是類脂A，與O特異性多糖和非特異性多糖共同組成LPS,革蘭陰性菌死亡后可裂解釋放LPS并進入血循環(huán)[9-12]。LPS由于是兩性分子，在水環(huán)境中形成高于臨界膠束濃度的多聚體。LPS進入血循環(huán)以多聚體的形式存在，對組織器官沒有直接損傷作用。LBP是由肝臟合成的急性期蛋白，是一種相對分子質量為60×103的糖蛋白，革蘭陰性桿菌感染后被釋放到血液中,能增強單核細胞和粒細胞對LPS的敏感性[13-14]。人LBP蛋白質是由26個氨基酸殘基的疏水性多肽片段和一個456個氨基酸殘基組成的蛋白質多肽鏈。LBP分子具有氨基(N)末端區(qū)域和羧基(C)末端區(qū)域，LPS多聚體需在LBP的N末端的參與下解聚為單體并形成LPS/LBP復合物后才能與單核-巨噬細胞等炎癥效應細胞上的CD14結合，形成LPS/LBP/CD14三元復合物，從而啟動LPS炎癥信號通路[15-19]。因此，理想的研究策略應是封閉CD14上與LPS/LBP復合物結合的功能域，讓LPS/LBP復合物不能與CD14結合而啟動LPS炎性通路，又可通過肝臟細胞吞噬、清除，甚至還保留了LBP調理巨噬細胞、中性粒細胞等對LPS進行吞噬清除的效應。以往的研究存在孤立考慮LBP與CD14結合的問題，因此推測CD14具有特異地與LPS/LBP復合物結合的功能域，尋找這一特殊的功能域，可能找到一種更為有效的拮抗內毒素的治療方法。因此，在研究CD14與LPS/LBP復合物結合的功能域時，需要獲得純度較高的LPS/LBP復合物。而目前并無商品化的復合物出售。本研究采用溫孵法、電泳分離法及膠回收法構建LPS/LBP復合物，結果表明初步獲得了可用于研究的LPS/LBP復合物。

構建LPS/LBP復合物涉及以下LPS與LBP幾個問題：①LPS與LBP應該以多少比例混勻孵育；②如何分離LPS與LBP混合物中游離的LPS和LBP，獲得相對純化的LPS/LBP復合物；③如何回收LPS/LBP復合物，并鑒定LPS已與LBP結合。由于目前關于LBP與LPS的結合比例尚無明確的數據，針對這些問題設計實驗。因此設計了LPS︰LBP分別為15︰1、10︰1及5︰1三個梯度比例組，目的是為了保證LPS對LBP處于相對飽和的濃度，并探索最佳的LPS與LBP結合比例。由于不能確定最佳的LPS與LBP比例，并且溫孵過程中存在一些不可控的因素，即使LPS︰LBP按最佳比例混勻，仍會有少量游離的LPS和LBP存在于混合物中。為獲得純度較高的LPS/LBP復合物。對LPS/LBP混合物進行了聚丙烯酰胺凝膠電泳。同時設置了單純的LBP組和LPS組作為對照。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種常用的蛋白質分析技術[20]。十二烷基硫酸鈉-聚丙稀醜胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)法經過多次改進,在蛋白質分離、鑒別、純化等方面的優(yōu)越性逐漸顯示出來[21]。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異,從而使蛋白樣品在電場中遷移[22-26]。LPS/LBP混合物中的LBP為蛋白質，可以在凝膠電泳中遷移，并大約在相對分子質量51×103處形成電泳條帶。而LPS的主要成分是多糖，且其相對分子質量僅為1×103左右。一方面其在凝膠中不能像蛋白質一樣遷移，另一方面即使能形成電泳條帶，也會距相對分子質量52×103處較遠。因此通過這一方法可有效地去除LPS/LBP混合物中游離的LPS。

雖然聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠有效去除LPS/LBP混合物中游離的LPS，但這一方法并不能去除LPS/LBP混合物中游離的LBP。為了盡量減少LPS/LBP混合物中游離的LBP，本實驗設計了LPS︰LBP分別為15︰1、10︰1及5︰1三個梯度比例組。而研究結果也表明，LPS︰LBP為15︰1和10︰1兩組經凝膠電泳回收后檢測的內毒素濃度顯著高于LPS︰LBP為5︰1這一組。并且LPS︰LBP為15︰1和10︰1兩組間的內毒素濃度無顯著差異。以上結果表明，當LPS︰LBP為5︰1時尚有部分LBP未與LPS結合；當LPS︰LBP為10︰1時LBP能充分與LPS結合；而 LPS︰LBP 為15︰1時復合物中LPS濃度未顯著提高也證明LPS︰LBP為10︰1是較為合理的構建LPS/LBP復合物的比例。

為了排除經凝膠電泳回收后的各條帶中檢測到的內毒素不是由游離內毒素在凝膠電泳過程中自由彌散所致的污染。本實驗同時切取了單獨的LBP組及相對分子質量52×103水平處的LPS泳道上的凝膠，回收后檢測內毒素。結果表明，無論是LBP組還是LPS組，其回收的凝膠條帶內均未檢測到內毒素。這一結果進一步確證LPS/LBP復合物中的內毒素確與LBP相結合。

綜上所述，本研究結果表明采用LPS︰LBP為10︰1是較為合理的構建LPS/LBP復合物的比例，這一比例可盡量減少了LPS/LBP復合物中的游離LBP。聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠有效去除LPS/LBP混合物中游離的LPS，獲得純度較高的LPS/LBP復合物。通過以上方法，本實驗初步構建了較高純度的LPS/LBP復合物，為進一步探索CD14在內毒素性應答中的相關功能域，篩選該位點的抑制劑，為早期防治內毒性ARDS提供了防治策略。

1 牛莎, 張睢揚. 膿毒癥和膿毒癥休克抗感染治療進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2013, 6(3): 202-204.

2 Oblak A, Jerala R. The molecular mechanism of species-specific recognition of lipopolysaccharides by the MD-2/TLR4 receptor complex[J]. Mol Immunol, 2015, 63(2): 134-142.

3 Li CH, Zuo HL, Zhang Q, et al. Analysis of soluble proteins in natural cordyceps sinensis from different producing areas by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional electrophoresis[J]. Pharmacognosy Res, 2017, 9(1): 34-38.

4 Kopp F, Kupsch S, Schromm AB. Lipopolysaccharide-binding protein is bound and internalized by host cells and colocalizes with LPS in the cytoplasm: Implications for a role of LBP in intracellular LPS-signaling[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1863(4): 660-672.

5 Stasi A, Intini A, Divella C, et al. Emerging role of lipopolysaccharide binding protein in sepsis-induced acute kidney injury[J]. Nephrol Dial Transplant, 2016, pii: gfw250.

6 Dauphinee SM, Karsan A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells[J]. Lab Invest, 2006, 86(1): 9-22.

7 Fujihara M, Muroi M, Tanamoto K, et al. Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide: roles of the receptor complex[J]. Pharmacol Ther, 2003, 100(2): 171-194.

8 Park BS, Lee JO. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes[J]. Exp Mol Med, 2013, 45(12): e66.

9 Miyake K. Innate recognition of lipopolysaccharide by CD14 and toll-like receptor 4-MD-2: unique roles for MD-2[J]. Int Immunopharmacol, 2003, 3(1): 119-128.

10 Ryu JK, Kim SJ, Rah SH, et al. Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for Efficient LPS Recognition and Transfere[J]. Immunty, 2017, 46(1): 38-50.

11 Jiao YL, Wu MP. Apolipoprotein A-I diminishes acute lung injury and sepsis in mice induced by lipoteichoic acid[J]. Cytokine, 2008, 43(1): 83-87.

12 Chen YY, Lien JM, Peng YS, et al. Lipopolysaccharide binding protein in cirrhotic patients with severe sepsis[J]. J Chin Med Assoc, 2014, 77(2): 68-74.

13 Café-Mendes CC, Garay-Malpartida HM, Malta MB, et al. Chronic nicotine treatment decreases LPS signaling through NF-κB and TLR-4 modulation in the hippocampus[J]. Neurosci Lett, 2016, doi: 10.1016/j.neulet.2016.10.056.

14 Zweigner J, Schumann RR, Weber JR. The role of lipopolysaccharide- binding protein in modulating the innate immune response[J]. Microbes Infect, 2006, 8(3): 946-952.

15 Fang L, Xu Z, Wang GS, et al. Directed evolution of an LBP/CD14 inhibitory peptide and its anti-endotoxin activity[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e101406.

16 Vreugdenhil AC, Rousseau CH, Hartung T, et al. Lipopolysaccha-ride (LPS)-binding protein mediates LPS detoxification by chylomicrons[J]. J Immunol, 2003, 170(3): 1399-1405.

17 馮起甲, 徐智, 吳國明, 等. 脂多糖結合蛋白與CD14結合位點模擬肽的初步篩選[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2007, 29(16): 1572-1575.

18 Chen KF, Chaou CH, Jiang JY, et al. Diagnostic accuracy of lipopolysaccharide-binding protein as biomarker for sepsis in adult patients: a systematic review and Meta-analysis[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153188.

19 Park BS, Lee JO. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes[J]. Exp Mol Med, 2013, 45: e66.

20 Sheen H. Quantitation of yeast total proteins in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer for uniform loading[J]. Anal Biochem, 2016, 498: 95-97.

21 Manabe T, Jin Y. Analysis of protein/polypeptide interactions in human plasma using nondenaturing micro-2-DE followed by 3-D SDS-PAGE and MS[J]. Electrophoresis, 2007, 12(28): 2065-2079.

22 Brunelle JL, Green R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE)[J]. Methods Enzymol, 2014, 541: 151-159.

23 Alu′datt MH, Rababah T, Alhamad MN, et al. Molecular characterization and bio-functional property determination using SDS-PAGE and RP-HPLC of protein fractions from two Nigella species[J]. Food Chem, 2017, 230: 125-134.

24 Ilavenil S, Al-Dhabi NA, Srigopalram S, et al. Removal of SDS from biological protein digests for proteomic analysis by mass spectrometry[J]. Proteome Sci, 2016, 14(1): 11.

25 Pant P, Singh RG, Usha, et al. Serum sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of patients with membranous nephropathy and focal and segmental glomerulosclerosis[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2016, 27(3): 539-545.

26 Hempelmann E, Krafts K. The mechanism of silver staining of proteins separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Biotech Histochem, 2017, 92(2): 79-85.

(本文編輯：黃紅稷)

鄭珍容，賀斌峰，魏征華，等. 脂多糖/脂多糖結合蛋白復合物的初步構建[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 173-177.

Preliminary constructing of lipopolysaccharide/lipopolysaccharide complexes

ZhengZhenrong,HeBinfeng,WeiZhenghua,WangGuansong,JiFuyun,XuZhi.

InstituteofRespiratoryDiseases,KeyLaboratoryofRespiratoryDiseasesResearch,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

XuZhi,Email:xuzhi201211@163.com

Objective To construct lipopolysaccharide/lipopolysaccharide binding protein(LPS/LBP) complexes by incubation for further study of LPS inflammatory signaling pathway. Methods LPS and LBP were mixed at following ratio: 15︰1, 10︰1 and 5︰1. The LPS/LBP mixtures, LBP (200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml) and LPS (100 μg/ml, 50 μg/ml) were incubated in constant temperature shaker overnight. The LPS/LBP mixtures, LBP and LPS were separate by gel electrophoresis. All the bands were harvested after coomassie blue staining for protein recovery, and endotoxin test. Results At relative molecular mass 52×103, LPS/LBP mixture groups and LBP groups appeared Coomassie blue staining bands, LPS groups didn′t show it. The higher concentration of LBP had the darker band . The endotoxin tests of all LPS/LBP mixture groups were positive. The endotoxin concentration of 15︰1 and 10︰1 LPS/LBP mixture groups were significantly higher than that of 5︰1 LPS/LBP mixture group(P<0.05). There was no significant difference between the endotoxin concentrations of 15︰1 and 10︰1 LPS/LBP mixture groups(P>0.1). The endotoxin tests of all LBP groups were negative. LPS groups aslo showed negative results for endotoxin test. Conclusions The ideal ratio of LPS︰LBP to construct LPS/LBP complex is 10︰1. Purified LPS/LBP complex can be obtained by incubation and gel electrophoresis.

Lipopolysaccharide; Lipopolysaccharide binding protein; Complexes; Construction

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.012

國家自然科學基金資助項目(81370169)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸內科 全軍呼吸內科研究所 全軍呼吸病研究重點實驗室

徐智， Email: xuzhi201211@163.com

Q503，Q513

A

2017-03-09)