DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)及其作用

劉霞 郭小莉 雷傳江 王關(guān)嵩 王建春

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·論著·

DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)及其作用

劉霞 郭小莉 雷傳江 王關(guān)嵩 王建春

目的探討死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)及在炎癥失控中的作用。 方法將30只雄性C57小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對照組、LPS誘導(dǎo)急性肺損傷3、6、12、24 h組。應(yīng)用2 mg/kg DAPK1抑制劑TC-DAPK 6預(yù)處理小鼠后，再用10 mg/kg LPS誘導(dǎo)小鼠肺損傷。HE染色光鏡觀察小鼠肺組織病理改變；免疫組化檢測肺組織中DAPK1的表達(dá)和分布；應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測肺組織DAPK1和NF-κB p65的表達(dá)；ELISA檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6水平變化；Kaplan-Meier生存分析對各組小鼠存活時間進(jìn)行分析。結(jié)果LPS致傷組肺組織可見明顯病理損傷改變且隨時間進(jìn)展加重，而DAPK1蛋白在正常對照組小鼠肺組織僅少量表達(dá)，在急性肺損傷小鼠肺組織中表達(dá)隨時間進(jìn)展明顯增加；與正常對照組相比，LPS組肺組織DAPK1 mRNA蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05)，血漿炎癥因子TNF-α、IL-6均明顯升高(P<0.05)。抑制小鼠肺DAPK1表達(dá)可明顯降低LPS誘導(dǎo)的肺組織中DAPK1和NF-κB p65蛋白水平、血清炎癥因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.05)。此外，抑制DAPK1可延長LPS致急性肺損傷小鼠的生存期(P<0.01)。 結(jié)論DAPK1通過調(diào)控NF-κB炎癥通路參與了LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，其可作為潛在的治療靶點。

死亡相關(guān)蛋白激酶1； 急性肺損傷； 核因子κB

急性肺損傷(acute lung injury, ALI) /急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 是臨床常見的由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等多種因素誘發(fā)的以難治性低氧血癥為特征的危重癥[1-3]，目前認(rèn)為多種炎癥細(xì)胞參與引起的炎癥失控導(dǎo)致肺實質(zhì)彌漫性損傷是ALI /ARDS 的主要病理生理基礎(chǔ)[4-5]。

死亡相關(guān)蛋白激酶1(death associated protein kinase 1, DAPK1)是一種鈣調(diào)蛋白(CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，參與機(jī)體多種病理生理過程[6]。既往研究表明DAPK1是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子之一，廣泛參與多種途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7-8]。近來不斷有研究發(fā)現(xiàn)其除具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬外，在一系列炎癥調(diào)節(jié)中也具有重要作用[9]。Yoo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3，DAPK1抑制INF-γ、TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活，可抑制環(huán)氧合酶-2和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的產(chǎn)生。為此，本研究采用LPS復(fù)制肺損傷小鼠模型，觀察肺組織DAPK1的表達(dá)及炎癥介質(zhì)的釋放情況，并應(yīng)用DAPK1的特異性抑制劑TC-DAPK 6預(yù)處理小鼠后，再觀察LPS誘導(dǎo)小鼠的肺損傷嚴(yán)重程度、炎癥因子的水平以及小鼠的生存時間，進(jìn)而探討DAPK1在LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、試劑與材料

1. 實驗動物: 30只雄性6～8周齡C57BL/6小鼠(體質(zhì)量22±2 g)購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

2. 主要試劑: HE染色病理切片由新橋醫(yī)院中心實驗室完成，免疫組化試劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司; ELISA 試劑盒購自上海滬尚科技有限公司; 蛋白提取試劑盒、蛋白酶抑制劑、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光顯影液均購自美國Thermo 公司；LPS 購自Sigma 公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自碧云天公司；DAPK1和NF-κB p65兔抗鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司；GAPDH 兔多克隆一抗、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔購自北京中杉金橋生物有限公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；DAPK1抑制劑購自美國MedChemExpresss公司。

二、研究方法

1. 實驗動物ALI模型構(gòu)建: 30只雄性6～8周齡C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對照組、LPS致肺損傷3、6、12、24 h組。LPS處理組LPS(10 mg/kg)腹腔注射以建立急性肺損傷模型，正常對照組不處理。處理完畢后將動物放回籠內(nèi)自由活動，不禁食水。小鼠在LPS等其他因素干預(yù)后，應(yīng)用干冰將其窒息死亡，并取相應(yīng)的標(biāo)本。

2. 肺組織病理學(xué)檢查： 取小鼠右肺組織于10%中性甲醛固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，HE 染色，最后封固，常規(guī)光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

3. 免疫組化檢測小鼠肺組織DAPK1表達(dá)情況： 取小鼠肺組織右肺葉標(biāo)本行免疫組化S-P 法染色，采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)高溫高壓抗原修復(fù)，常規(guī)透膜，5% BSA 室溫封閉1 h，滴加一抗(1︰250) 4 ℃過夜。HRP 標(biāo)記的二抗(1︰1 000) 37 ℃孵育1 h，DAB顯色，自來水沖洗終止，蘇木精復(fù)染10 min 后返藍(lán)，烤干組織切片，中性樹膠封片，鏡下觀察。

4. Real-time PCR： 使用TRIzol 法提取小鼠肺組織總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度。將mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測各樣本DAPK1表達(dá)，反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共38 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，計算平均值。引物由金斯瑞(南京)生物科技有限公司設(shè)計合成。引物序列: DAPK1 上游引物5′-ATGACTGTGTTCAGGCAGG AA-3′，下游引物5′-CCGGTACTTTTCTCACGACATTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為107 bp。

5. ELISA 檢測血漿TNF-α、IL-6 水平: 在相應(yīng)時點眼球取血，4 ℃低溫離心(以離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心10 min)，分離出血漿，按照ELISA 試劑盒說明書檢測各標(biāo)本血漿TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平。每樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)雙復(fù)孔，獲取酶標(biāo)儀450 nm 處光密度(OD)值，并根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本TNF-α、IL-6 含量，取平均值為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

6. DAPK1抑制劑預(yù)處理小鼠以及Western blot 檢測DAPK1、NF-κB p65在肺組織的蛋白表達(dá): 因DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中表達(dá)明顯增加，且24 h達(dá)到最高，故選擇DAPK1特異性抑制劑抑制其表達(dá)。DAPK1 選擇性抑制劑TC-DAPK 6(2 mg/kg)腹腔注射注入小鼠體內(nèi)，1 h后再接受LPS(10 mg/kg) 腹腔注射建立肺損傷模型，24 h后檢測DAPK1蛋白表達(dá)、促炎基因表達(dá)及炎癥因子表達(dá)水平。按蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織總蛋白，濃度經(jīng)微量核酸蛋白檢測儀測定。各標(biāo)本取等量蛋白樣品進(jìn)行8% SDS-PAGE 電泳2 h (恒壓80 V) ，轉(zhuǎn)膜(恒流300 mA，70～160 min)，5%BSA封閉1 h，分別加入DAPK1和NF-κB p65一抗(1︰1 000) 、GAPDH 一抗(1︰3 000) ，4 ℃過夜。TBST洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗(羊抗IgG，1︰5 000)37 ℃孵育1 h ，TBST洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光法顯色成像。用Quantity One 軟件測定各條帶積分光密度值，以GAPDH條帶校正。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、小鼠肺組織病理學(xué)改變和血清炎癥因子TNF-α、IL-6的水平

光鏡下觀察肺組織HE染色可見：正常對照組小鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄而光滑，邊緣完整，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤滲出。LPS致肺損傷3、6、12、24 h 組小鼠肺組織均可見肺組織毛細(xì)血管充血水腫，肺泡間隔增厚，部分肺泡塌陷，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)可見液體滲出，肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度隨時間增加而加重(圖1A)。檢測LPS致肺損傷組小鼠各個時間點的血清炎癥因子水平，發(fā)現(xiàn)在對照組和LPS處理小鼠血清TNF-α和IL-6水平在3 h時分別為65.59±2.24 ng/L和59.36±2.26 ng/L，6h時分別為174.95±5.50 ng/L和111.39±5.00 ng/L，12 h時分別為376.20±4.88 ng/L和204.12±4.86 ng/L，24 h時分別為379.28±2.69 ng/L和206.09±3.23 ng/L。LPS損傷后，各個時間點的血清TNF-α和IL-6水平均顯著高于對照組(P<0.05)，并且隨著LPS作用時間的延長而升高，但是LPS處理12 h和24 h時相點血清TNF-α、IL-6水平均無顯著差異(圖1B、C)(P>0.05)。

二、LPS致小鼠ALI后DAPK1肺組織的表達(dá)

免疫組化示在正常肺組織中DAPK1少量表達(dá)于肺組織，而在LPS處理后，隨著肺損傷的逐漸加重，肺組織中表達(dá)DAPK1的細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增多(圖2A)。Western blot 檢測結(jié)果顯示(圖2B)，LPS干預(yù)小鼠后各個時相點肺組織DAPK1的蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.05)，在24 h時相點表達(dá)最高。qPCR檢測(圖2C)同樣發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)小鼠后各個時相點肺組織DAPK1 mRNA的表達(dá)高于對照組(P<0.05)，并且在24 h時表達(dá)最高。同時，LPS干預(yù)小鼠6 h后肺組織中DAPK1 mRNA表達(dá)也明顯低于3 h、12 h和24 h時的表達(dá)(P<0.05)。

三、DAPK1抑制后肺損傷小鼠肺組織中DAPK1、NF-κB p65的表達(dá)

本研究使用DAPK1的選擇性抑制劑TC-DAPK 6預(yù)處理小鼠后，再用10 mg/kg LPS腹腔注射24 h后取標(biāo)本，病理結(jié)果顯示(圖3A)，TC-DAPK 6預(yù)處理小鼠后，可明顯降低LPS誘導(dǎo)小鼠肺損傷。qPCR檢測結(jié)果示(圖3B)，LPS可顯著增加DAPK1 mRNA表達(dá)(P<0.05)，而TC-DAPK 6可顯著逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的DAPK1 mRNA的升高(P<0.05)。Western blot 檢測結(jié)果顯示(圖3C)，在LPS誘導(dǎo)組DAPK1與NF-κB p65蛋白較對照組呈高表達(dá)(P<0.05)，而TC-DAPK 6預(yù)處理后再用LPS處理，DAPK1與NF-κB p65蛋白的表達(dá)顯著低于LPS處理組(P<0.05)。

四、DAPK1抑制后肺損傷小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6的變化及生存期分析

本研究使用TC-DAPK 6抑制DAPK1及其NF-κB p65的表達(dá)后，用ELISA檢測血清TNF-α和IL-6的變化，control組、LPS組和TC-DPAK 6組的血清TNF-α和IL-6水平分別為63.33±2.53 ng/ml和59.86±3.14 ng/ml、378.06±7.59 ng/ml和207.07±6.14 ng/ml、225.68±7.45 ng/ml和146.07±3.34 ng/ml。TC-DPAK 6組和LPS組的血清TNF-α和IL-6水平顯著高于Control組(P<0.05)，而TC-DPAK 6組的血清TNF-α和IL-6水平明顯低于LPS組，P<0.05(圖4A、B)。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，TC-DPAK 6組小鼠的生存期顯著長于LPS組，P<0.01(圖4C)。

討 論

ARDS 是臨床常見的危重癥，其發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜。目前認(rèn)為多種炎癥細(xì)胞(如多核白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞)及肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞等均參與ARDS的發(fā)生、進(jìn)展。其主要機(jī)制是通過炎癥細(xì)胞可釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，引起肺不張，通氣/血流比例失調(diào)；而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，導(dǎo)致血管通透性增加發(fā)生肺水腫，引起ARDS 的主要病理改變，繼而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，失控的SIRS進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，ARDS則是MODS的一個重要組成部份。因此，目前認(rèn)為急性肺損傷ALI/ARDS的本質(zhì)是一種炎癥，其發(fā)病與炎癥的失控密切相關(guān)[4, 11]。盡管近年來人們對 ARDS 研究不斷深入，診療技術(shù)有明顯提升，但其病死率仍然居高不下，重度ARDS患者病死率仍高達(dá)40%[12]。

圖1 LPS致大鼠急性肺損傷；注：A.HE染色觀察LPS處理小鼠不同時間點肺組織的損傷(×20)；①對照組；② LPS處理3 h；③LPS處理6 h；④LPS處理12 h；⑤ LPS處理24 h；B. ELISA檢測血清TNF-α、IL-6水平；*，與control組比較,P<0.05; ^,與LPS處理3 h組比較,P<0.05; #,與LPS處理6 h組比較，P<0.05

圖2 LPS致小鼠急性肺損傷各個時相點DAPK1的表達(dá)及定位。A.免疫組化染色觀察LPS處理小鼠不同時間點對肺組織中DAPK蛋白的定位和表達(dá)(×20)；注：①對照組；②LPS處理3 h；③LPS處理6 h；④ LPS處理12 h；⑤ LPS處理24 h；B. Western blot檢測LPS致小鼠急性肺損傷各個時相點DAPK蛋白的表達(dá)情況；C. qPCR檢測LPS致小鼠急性肺損傷各個時相點DAPK mRNA的表達(dá)情況；*與control組比較P<0.05； ^與LPS處理3 h組比較，P<0.05；#與LPS處理6 h組比較，P<0.05；&與LPS處理12 h組比較，P<0.05

圖3 TC-DAPK 6抑制LPS誘導(dǎo)的肺損傷，下調(diào)DAPK1及NF-κB p65的表達(dá)；注：A: HE染色觀察TC-DAPK 6預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷(×20). 1: 單獨LPS組；2:TC-DAPK 6+LPS組；B：qPCR檢測DAPK1的表達(dá)水平。*與control組比較P<0.05； ^與LPS組比較P<0.05；C：Western blot檢測DAPK1和NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況

DAPK1作為凋亡正性調(diào)節(jié)因子，廣泛參與TGF-β、IFN-γ、TNF-α和Fas等多種途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7-8]。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)DAPK1在一系列炎癥調(diào)節(jié)中也具有重要作用。在腸上皮細(xì)胞，DAPK1抑制TNF-α誘導(dǎo)的STAT3激活和IL-6產(chǎn)生；DAPK1在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)慢性炎癥中起保護(hù)作用；在TNF-α誘發(fā)的血管炎也發(fā)現(xiàn)，DAPK通過抑制NF-κB 活性發(fā)揮抗炎作用；在DAPK敲除鼠模型，給予小劑量LPS經(jīng)鼻吸入刺激后，肺泡灌洗液中KC、IL-6分泌增加，肺上皮細(xì)胞P65核異位增加[13-16]。然而，DAPK1在IL-1β的產(chǎn)生中起重要作用；抑制DAPK1表達(dá)可顯著減少巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-8分泌[17-18]。因此，DAPK1在炎癥調(diào)節(jié)中既有正向調(diào)節(jié)作用，也有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，而這種參與炎癥調(diào)節(jié)的不同作用可能與DAPK1影響NF-κB活性及細(xì)胞種類相關(guān)[19]。在本實驗中，LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型中肺組織DAPK1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增高，且隨時間延長有明顯上升趨勢，與此同時，血漿炎癥因子TNF-α、IL-6也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。因此，我們推測DAPK1參與了LPS致小鼠急性肺損傷的進(jìn)程，并且DAPK1的表達(dá)可能與炎癥因子水平有相關(guān)。

既往研究表明，NF-κB在急性肺損傷時表達(dá)增多，是調(diào)控炎癥介質(zhì)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞受到刺激后進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因DNA 接觸調(diào)控IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥介質(zhì)的表達(dá)合成[20]。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)小鼠肺損傷后，NF-κB顯著升高。我們采用DAPK1特異性抑制劑抑制小鼠肺DAPK1表達(dá)后， 發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白水平及血清炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均明顯下降。提示DAPK1可通過NF-κB調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，但具體機(jī)制尚不清楚。

圖4 TC-DAPK 6下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠血清炎癥因子血清IL-6、TNF-α水平并延長小鼠生存期；注：A和B，ELISA檢測血清TNF-α、IL-6水平。*與control組比較,P<0.05; ^與LPS處理組比較，P<0.05；C：Kaplan-Meier生存分析小鼠生存時間。*與LPS組比較,P<0.05

綜上所述，本研究結(jié)果表明，急性肺損傷小鼠肺組織DAPK1表達(dá)明顯上升，血漿炎癥因子TNF-α、IL-6大量釋放，通過抑制DAPK1表達(dá)后NF-κB p65蛋白水平及血清炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均明顯下降，提示DAPK1參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，加重肺部炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與增強NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，但其具體作用及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。結(jié)合既往研究結(jié)果，表明DAPK1在LPS誘導(dǎo)急性ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其可作為ALI/ARDS治療的新靶點。

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(本文編輯：王亞南)

劉霞，郭小莉，雷傳江，等. DAPK1在急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)及其作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 151-156.

Expression and function of DAPK1 in lung tissues of mouse with acute lung injury

LiuXia,GuoXiaoli,LeiChuanjiang,WangGuansong,WangJianchun.

DepartmentofRespiratoryDisease,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

WangJianchun,Email:wjc5577@126.com

Objective To investigate the expression of death associated protein kinase 1(DAPK1) in lung tissues of mouths with LPS induced acute lung injury(ALI) and its function in ALI. Methods Thirty C57 male mice were randomly divided into 5 groups: control group, LPS induced acute lung injury group for 3 h, 6 h, 12 h and 24 h group. Histological changes of the lungs were observed by HE staining; The expression and distribution of DAPK1 in the lung tissues was detected by western blot, qPCR and Immunohistochemistry. The serum levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA. Six mice were pretreated with 2 mg/kg TC-DAPK 6, a selectivity DAPK1 inhibitor, and then 10 mg/kg LPS was used to induce mice acute lung injury by intraperitoneal injection. The expression of DAPK1 and NF-κB p65 was evaluated using western blot and qPCR, and ELISA was used to analyze the level of serum TNF-α and IL-6. Kaplan-Meier analysis was evaluated the lifespan of these mice. Results The HE stain showed that pathological of lung tissue damage became severe along with time. Immunohistochemistry demonstrated that. The area of DAPK1 protein expression was more large with time increased in LPS group, compared to control group (P<0.05).The level of serum TNF-α and IL-6 was significantly higher than control group (P<0.05). The expression of DAPK1 and NF-κB p65 and serum TNF-α and IL-6 level was significantly decreased after pretreated with TC-DAPK 6 and stimulated with LPS, compared to LPS alone group (P<0.05). Moreover, Kaplan-Meier analysis showed the lifespan of mice by pretreated with TC-DAPK 6 was longer than LPS alone group (P<0.01). Conclusion DAPK1 involved in LPS induced mice acute lung injury by modulation NF-κB p65 and the production and released of inflammation mediator. It might be a potential target for ALI/ARDS treatment.

Death associated protein kinase 1; Acute lung injury; Nuclear factor-κB

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.008

國家自然基金面上資助項目(81170066)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科

王建春， Email: wjc5577@126.com

R563

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2017-01-11)