硫化氫中毒案件中血液硫離子的測定

強火生，陳航，沈保華，沈敏，向平

（1.溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州 325035；2.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063）

·論著·

硫化氫中毒案件中血液硫離子的測定

強火生1，2，陳航2，沈保華2，沈敏2，向平1，2

（1.溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州 325035；2.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063）

目的建立血液中硫離子的氣相色譜-質譜（GC-MS）測定方法，并將其應用于實際案例。方法取血液0.2mL，以1，3，5-三溴苯為內標，經五氟芐基溴衍生化后采用GC-MS分析。結果血液中的硫離子在0.2～40μg/mL質量濃度范圍內線性良好，最低檢出限為0.05μg/mL。健康人群、死后等不同來源的空白血液中硫離子質量濃度不高于0.05μg/mL。3例硫化氫中毒案件中，6名死者血液中均檢出硫離子，質量濃度在1.02～3.13μg/m L。結論本研究建立了血液中硫離子測定方法，并成功應用于硫化氫中毒死亡案件。

法醫(yī)毒理學；中毒；硫化氫；衍生化；氣相色譜-質譜聯(lián)用法

硫化氫（H2S）為無色劇毒氣體，有刺激性的臭雞蛋氣味。人體吸入硫化氫氣體后，會損傷肺泡毛細血管，破壞肺泡表面活性物質，造成呼吸道黏膜的急性損傷和急性肺水腫[1-3]。吸入少量高濃度硫化氫可引起呼吸驟停，造成“閃電式”死亡。由于在許多工業(yè)生產和生活環(huán)境中，如采礦、造紙、廢水處理、下水道清理等都有硫化氫存在，因此硫化氫中毒事故頻發(fā)[4-6]。

血液中硫化氫測定可作為中毒確認的直接證據(jù)，但一直是法醫(yī)毒物學領域的難點[7]。急性中毒發(fā)生快，體內含量低，硫化氫在體內大部分經氧化代謝形成硫代硫酸鹽和硫酸鹽[8]。此外，體內存在內源性硫化物，而體內含硫有機質的腐敗分解，可釋放出硫化氫，尸體血液和組織中的含硫量可能受尸體腐敗等因素干擾[9]。因此，如何準確地測定血液中硫離子濃度，并且積累基礎數(shù)據(jù)顯得尤為重要。

生物檢材中硫化氫測定可采用化學顯色法、氣相色譜、液相色譜、離子色譜等方法[10-14]，主要分為兩大類，一類是在酸性條件下測定非離子型的硫化氫[15]，另一類為堿性條件下分析離子型的硫化氫[14，16]。第一類方法的靈敏度和特異性在急性中毒案例中應用有局限性，目前研究較多的是第二類方法，衍生化后采用氣質聯(lián)用儀檢測，其中日本Kage等[17]研發(fā)的五氟芐基溴衍生化方法具有檢材用量少、預處理簡單、檢測時間短等優(yōu)點，因而被廣泛采用。我國亦有參照此衍生化方法測定血液中硫化物的方法，但此法尚存在缺陷[18]，難以應用于實踐。本研究擬參照上述的五氟芐基溴衍生化方法，建立血液中硫離子的氣相色譜-質譜（GC-MS）測定方法，并應用于實際案例，探討該測定技術的要點和結果評價問題。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

7890 A GC-5975C MSD氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、7683B自動進樣器、MSD ChemStation工作站（美國Agilent公司）。

無水硫化鈉（Na2S，純度90%）、十四烷基二甲基芐基氯化銨（tetradecyl dimethyl benzyl ammonium chloride，TDMBA，99%）、磷酸二氫鉀（KH2PO4，≥99%）、五氟芐基溴（pentafluorobenzyl bromide，PFBBr，98%）和1，3，5-三溴苯（tribromobenzene，TBB，＞98%）均購自中國百靈威科技有限公司；無水四硼酸鈉（Na2B4O7，＞99.5%）購自中國安譜實驗科技股份有限公司；對二甲苯（C8H10，99%）購自上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯、丙酮均為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司；去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 血液樣品

空白血液樣品取自于近期未服用任何藥品的健康志愿者和本實驗室實際案例中常見毒（藥）物篩選陰性的血液樣品。

1.3 溶液配制

本研究所用水為實驗當天將氮氣通入去離子水中脫氧15min以上制備所得的無氧水。

飽和Na2B4O7溶液：稱取Na2B4O7足量，加入無氧水1 000mL加熱溶解，充分超聲，自然冷卻后，取上層清澈溶液。

硫離子儲備液：精密稱取Na2S 108.3mg，用飽和Na2B4O7溶液定容至100mL。臨用時根據(jù)需要稀釋成適當質量濃度的標準溶液。

TDMBA溶液：精密稱取TDMBA 184.0mg，用飽和Na2B4O7溶液定容至100mL，搖勻。

PFBBr的對二甲苯溶液：精密稱取PFBBr 208.8mg，用對二甲苯溶液定容至40mL，搖勻。

TBB（內標）：精密稱取TBB 3.2mg，用乙酸乙酯溶液定容至100m L，搖勻得10μmol/L的內標；準確吸取10μmol/L內標1mL，用乙酸乙酯溶液定容至100mL，搖勻。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25mm）毛細管柱；柱溫升溫程序為起始溫度100℃，保持1.5min后，以40℃/min升至280℃，保持5min；載氣為高純氦氣，恒流1.0mL/min；進樣口溫度280℃；進樣量0.2μL；分流比20∶1。

質譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量70eV；離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度280℃。硫離子衍生化后生成雙五氟芐硫醚（C6F5CH2SCH2C6F5），特征碎片離子質荷比（m/z）為161、181、394，保留時間為5.4min；內標TBB特征碎片離子m/z為235、314，保留時間為4.8min。定量時采用選擇離子監(jiān)測（selected ion monitor，SIM）模式，硫離子和內標的定量碎片離子m/z分別為394和314。

1.5 樣品前處理

取血液0.2m L，置于已加入0.8mL TDMBA、0.5mL PFBBr的對二甲苯溶液和2.0mL內標的10mL玻璃試管中，渦旋1min，加入0.1 g KH2PO4，渦旋30 s，867×g，離心10min，吸取上清液于進樣瓶中，取0.2μL進樣。

1.6 方法驗證

本研究參照Peters等[19]的建議，驗證方法的專屬性、線性、檢測限、精密度、準確度和穩(wěn)定性，并應用于實際中毒死亡案例。

1.6.1 專屬性

取10份健康人、死后等不同來源的空白血液，按照1.5項處理后分析。

1.6.2 線性及其檢測限

空白血液中分別添加硫離子溶液適量，制得質量濃度分別為0.2、0.8、2、10、20、40μg/mL的系列樣品，按照1.5項處理后進行GC-MS分析，每個質量濃度點2個重復樣品。以目標物和內標峰面積之比為自變量（x），以硫離子的質量濃度（μg/mL）為因變量（y），進行線性回歸運算。以信噪比（S/N）≥3的質量濃度為最低檢出限（limit of detection，LOD），S/N≥10的質量濃度為最低定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.6.3精密度、準確度和穩(wěn)定性

空白血液中分別添加硫離子溶液適量，制得高、中、低（20、4、0.2μg/mL）3個質量濃度的質控樣品，每個質量濃度點6個重復樣品，按照1.5項處理后進行GCMS分析。計算每個濃度樣品的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）作為日內精密度；連續(xù)4 d，計算每種濃度樣品的RSD作為日間精密度。測得硫離子與內標物的峰面積比值，根據(jù)當日的工作曲線，計算各樣品的測得濃度（實測濃度），以實測濃度與理論濃度的比值計算準確度。按照1.5項處理后的3個質量濃度的質控樣品每隔1h進行GC-MS分析1次，連續(xù)進樣24h。以每個濃度樣品的RSD值計算穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 方法驗證

本方法特異性強，健康人群、死后等不同來源的空白血液中硫離子質量濃度不高于0.05μg/mL。

血液中的硫離子質量濃度在0.2～40μg/mL范圍內具有良好的線性關系，線性方程為y=20.97 x-1.186（R2=0.998）；本方法的LOD為0.05μg/mL，LOQ為0.2μg/mL（圖1）。

本方法日內和日間精密度均小于15%，而且準確度在（100±15）%以內（表1），穩(wěn)定性（RSD）均小于15%，均在法醫(yī)毒物學領域可接受范圍內。

2.2 案例應用

將所建立的硫離子測定方法應用于3例疑似硫化氫中毒案例，結果見表2。6名死者血液中均檢出硫離子，質量濃度范圍為1.02～3.13μg/mL。

圖1 空白血液中添加0.2μg/m L硫離子的GC-MS圖

表1 硫離子方法的精密度、準確度和穩(wěn)定性（%）

表2 硫化氫中毒案例的測定結果

3 討論

3.1 測定原理及方法

本研究使用五氟芐基溴衍生化方法，原理為堿性基質中硫離子的烷基化反應，生成的衍生物轉移至有機相后經GC-MS檢測，見圖2～3。烷基化試劑采用PFBBr，溶劑為對二甲苯。TDMBA為相轉移催化劑，溶解在堿性四硼酸鈉溶液中。烷基化反應、萃取過程同時進行，生成的硫衍生物轉移于對二甲苯和乙酸乙酯的有機相中，離心后直接進行GC-MS分析，非常簡便、快速。

圖2 硫離子衍生化反應方程式

圖3 硫離子測定方法流程

由于血液中的蛋白質分解即有硫化氫產生，所以，在此烷基化反應中如何避免基質中硫離子的生成非常重要。

首先，水溶液中溶解的氧可分解硫化氫，因此配制中使用的蒸餾水應先通氮氣脫氧，制備脫氧水。也可將蒸餾水煮沸10min，冷卻至室溫后使用。

堿性條件下，血液中的含硫化合物如半胱氨酸、谷胱甘肽等可分解生成硫離子，因此，樣品前處理中加樣順序十分重要。首先在試管中加入TDMBA、PFBBr衍生化試劑和內標溶液，然后再加入血液，混旋僅1min，進行衍生化反應。2012年羅才會等[18]報道的硫化物測定方法，雖然采用同樣的原理、試劑，但在加樣順序上，先將血液加至堿性溶液中，然后再加入PFBBr衍生化試劑和內標溶液，混旋1min后置于55℃恒溫搖床中振搖4h。本次實驗曾考察加樣放置室溫10min、30min后進樣，硫衍生物的峰面積明顯升高。

為進一步抑制血液基質中硫離子的生成，在衍生化反應1min后即加入磷酸二氫鉀，使溶液呈酸性，以淬滅反應。

GC-MS分析時，硫衍生物的檢測靈敏度非常高。由于生物基質中本身存在著硫離子，為了更直接地區(qū)分內源性與外源性的硫離子，本研究中使用的GC-MS儀器在參數(shù)設置時，通過不同來源的空白血液，考察硫衍生物的出峰情況。最終將進樣量設為0.2μL，分流比設為20∶1，使空白血液樣品不出現(xiàn)硫衍生物的特征色譜峰。

該儀器參數(shù)設置是根據(jù)自身分析設備進行，儀器狀態(tài)改變，需要重新考察空白血液樣品、調整儀器參數(shù)。鑒于空白血液中硫離子濃度與硫化氫中毒死者血液中硫離子濃度差別不大，各實驗室一定要充分積累空白血液與硫化氫中毒血液的硫離子濃度數(shù)據(jù)。

3.2 測定結果評價

由于血液中存在內源性硫離子以及檢材保存、腐敗產生等問題，硫化氫中毒的結果解釋與評價一直是法醫(yī)毒物學的難點問題[20]。尸檢延遲、環(huán)境溫度、檢材腐敗等因素均可導致含硫化合物分解、生成硫化氫，但事實上，生成的量不足以影響硫化氫中毒的測定。McAnalley等[21]報道空白血液中硫離子質量濃度不高于0.01μg/mL，同時發(fā)現(xiàn)，如果血液采集于死后24h內、放置溫度低于20℃，以及檢材冷藏或冷凍保存，硫化氫的死后生成都可得到抑制；血液在4℃冰箱中放置，一周后升高約10%；同時考察25例尸檢血液，其中2例已高度腐敗，但其中硫離子質量濃度均低于0.4μg/mL。Maebashi等[7]通過考察17例硫化氫中毒死亡案例，發(fā)現(xiàn)除了口服途徑中毒，血液中硫離子濃度與尸檢間隔時間沒有明顯相關性。

目前公認的空白血液中硫離子質量濃度低于0.05μg/mL[21，22]。本方法將血液中硫離子的LOD設定為0.05μg/mL，考察健康人群、死后等不同來源的血液，均未出現(xiàn)硫衍生物的特征色譜峰。

大部分硫化氫中毒為吸入高濃度硫化氫，但由于死亡迅速，血液中硫離子濃度升高程度與其他毒物相比并不明顯，但血液中硫離子濃度仍是推斷硫化氫中毒的最可靠指標。目前，文獻報道的硫化氫中毒案件中，吸入中毒者的血液中硫離子質量濃度在0.11～31.84μg/mL；口服含硫的清潔用品等中毒死亡案例中，血液中硫離子質量濃度可比正常水平高20倍以上，在30.4～131.2μg/mL（表3）。

表3 硫化氫中毒案例文獻資料

本研究中案例1為竹漿加工廠發(fā)生的事故，造紙廠的廢液可能產生包括硫化氫、甲硫醇等有毒硫氣體。兩名死者的血液中檢出硫離子、硫代硫酸根離子，肺組織中還檢出甲硫醇和甲硫醚。需要注意的是，不是所有硫中毒都源于硫化氫，有時需要分析其他有毒硫氣體成分。

案例2發(fā)生在工廠的車間，廢液排放的管道滲漏，生成的硫化氫被風倒灌入封閉的車間，導致3人死亡。其中一人血液中硫離子、硫代硫酸根離子濃度明顯高于另兩名死者，這與事故發(fā)生經過相一致，此人當時在該車間內打掃衛(wèi)生，經歷空氣中硫化氫濃度從無到慢慢升高的過程，中毒時程較長，進入體內的硫化氫總量高，并且有一定時間的代謝。而另兩名施救的死者在之后進入高濃度硫化氫環(huán)境中，急性中毒死亡。

案例3為排污管道窨井內發(fā)生的中毒事故，1 d后，現(xiàn)場勘驗人員打開窨井蓋10min，在井口可聞到較為明顯的臭雞蛋氣味，氣體檢測儀檢測到較高濃度的硫化氫。硫化氫中毒案件發(fā)生時，事故現(xiàn)場空氣中硫化氫濃度監(jiān)測非常必要。

3.3 結論

本研究建立了五氟芐基溴衍生化、GC-MS測定血液中硫離子方法，LOD為0.05μg/mL。健康人群、死后等不同來源的空白血液中硫離子質量濃度均低于0.05μg/mL。將該方法應用于3例硫化氫中毒案件中，6名死者血液中均檢出硫離子，質量濃度為1.02～3.13μg/mL。急性中毒案件中，血液中硫離子測定是硫化氫中毒判斷的可靠指標。

[1]何平.群體硫化氫中毒的急救及職業(yè)防護[J].臨床合理用藥，2015，8（6A）：152-153.

[2]岳茂興，徐冰心，李軼，等.硫化氫吸入中毒損傷特點和緊急救治[J].中華急診醫(yī)學雜志，2005，14（2）：175-176.

[3]吳娜，王滌新.硫化氫中毒機制及治療研究進展[J].中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2010，23（6）：434-436.

[4]王昊，鄧偉年，蔡型文，等.刺激性氣體急性中毒死亡法醫(yī)學鑒定6例[J].法醫(yī)學雜志，2011，27（6）：473-475.

[5]Kage S，Ikeda H，Ikeda N，et al.Fatal hydrogen sulfide poisoning at a dye works[J].Leg M ed（Tokyo），2004，6（3）：182-186.

[6]李暉.硫化氫中毒致四人“閃電式”死亡[J].法醫(yī)學雜志，2004，20（1）：32.

[7]Maebashi K，Iwadate K，Sakai K，et al.Toxicological analysis of 17 autopsy cases of hydrogen sulfide poisoning resulting from the inhalation of intentionally generated hydrogen sulfide gas[J].Forensic Sci Int，2011，207（1-3）：91-95.

[8]Shen X，Pattillo CB，Pardue S，et al.Measurement of plasma hydrogen sulfide in vivo and in vitro[J]. Free Radic Biol Med，2011，50（9）：1021-1031.

[9]Nagy P，Pálinkás Z，Nagy A，et al.Chem ical aspects of hydrogen sulfide measurements in physiological sam ples[J].Biochim Biophys Acta，2014，1840（2）：876-891.

[10]陳巧珍，胡克季，三浦恭之.間接熒光檢測離子色譜法分析維生素C、亞硫酸根和硫代硫酸根[J].色譜，1999，17（5）：480-482.

[11]楊永壇，楊海鷹，陸婉珍.催化柴油中硫化物的氣相色譜-原子發(fā)射光譜分析方法及應用[J].色譜，2002，20（6）：493-497.

[12]Zhang M，Deng M，Ma J，et al.An evaluation of acute hydrogen sulfide poisoning in rats through serum metabolomics based on gas chromatographymass spectrometry[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2014，62（6）：505-507.

[13]Chwatko G，Bald E.Determination of thiosulfate in human urine by high performance liquid chromatography[J].Talanta，2009，79（2）：229-234.

[14]陳梅蘭，范云場，葉明立，等.離子色譜柱后衍生光度法檢測食品中含硫的陰離子化合物[J].中國科學（B輯：化學），2009，39（8）：819-824.

[15]Colon M，TodolíJL，Hidalgo M，et al.Development of novel and sensitive methods for the determ ination of sulfide in aqueous samples by hydrogen sulfide generation-inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy[J].Anal Chim Acta，2008，609（2）：160-168.

[16]Ubuka T，Abe T，Kajikawa R，et al.Determination of hydrogen sulfide and acid-labile sulfur in animal tissues by gas chromatography and ion chromatography[J]. JChromatogr B Biomed Sci Appl，2001，757（1）：31-37.

[17]Kage S，Nagata T，Kimura K，et al.Extractive alkylation and gas chromatographic analysis of sulfide[J]. J Forensic Sci，1988，33（1）：217-222.

[18]羅才會，李劍波，于天曉，等.氣相色譜-質譜法測定硫化氫中毒血液中的硫化物[J].重慶醫(yī)科大學學報，2012，37（12）：1025-1028.

[19]Peters FT，Drummer OH，Musshoff F.Validation of new methods[J].Forensic Sci Int，2007，165（2-3）：216-224.

[20]Nagy P，Pálinkás Z，Nagy A，et al.Chem ical aspects of hydrogen sulfide measurements in physiological samples[J].Biochim Biophys Acta，2014，1840（2）：876-891.

[21]M cAnalley BH，Low ry WT，Oliver RD，et al.Determination of inorganic sulfide and cyanide in blood using specific ion electrodes：application to the investigation of hydrogen sulfide and cyanide poisoning[J].Journal of Analytical Toxicology，1979，3（3）：111-114.

[22]Kage S，Nagata T，Kudo K.Determination of thiosulfate in body fluids by GC and GC/MS[J].J Anal Toxicol，1991，15（3）：148-150.

[23]Kage S，Ito S，Kishida T，et al.A fatal case of hydrogen sulfide poisoning in a geothermal power plant[J].J Forensic Sci，1998，43（4）：908-910.

[24]Chaturvedi AK，Sm ith DR，Canfield DV.A fatality caused by accidental production of hydrogen sulfide[J]. Forensic Sci Int，2001，123（2-3）：211-214.

[25]Kage S，Kashimura S，Ikeda H，et al.Fatal and nonfatal poisoning by hydrogen sulfide at an industrialwaste site[J].JForensic Sci，2002，47（3）：652-655.

[26]Kobayashi K，F(xiàn)ukushima H.Suicidal poisoning due to hydrogen sulfide produced by m ixing a liquid bath essence containing sulfur and a toilet bow l cleaner containing hydrochloric acid[J].Chudoku Kenkyu，2008，21（2）：183-188.

[27]Ago M，Ago K，Ogata M.Two fatalities by hydrogen sulfide poisoning：variation of pathological and toxicological findings[J].Leg Med（Tokyo），2008，10（3）：148-152.

[28]Yajima Y，F(xiàn)unayama M，Hashiyada M，et al.An autopsy case of hydrogen sulfide poisoning in a fish feed processing factory[J].Res Pract Forensic Med，2003，46：199-202.

[29]Imamura T，Kage S，Kudo K，et al.A case of drowning linked to ingested sulfides--a report w ith animal experiments[J].Int JLegal Med，1996，109（1）：42-44.

[30]Nagata T，Kage S，Kimura K，et al.How to diagnose polysulphide poisoning from tissue samples[J]. Int J Legal Med，1994，106（6）：288-290.

Determ ination of Su lfide Ion in Blood from Hydrogen Sulfide Poisoning Cases

QIANG Huo-sheng1,2,CHEN Hang2,SHEN Bao-hua2,SHEN Min2,XIANG Ping1,2
（1.Pharmacy School of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice, PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo establish a gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）method for the determ ination of sulfide ion in blood and apply it to the practical cases.MethodsThe 1,3,5-tribromobenzene was selected as an internal standard,and 0.2m L blood sample was collected and analyzed using GC-MS afterα-Bromo-2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl brom ide derivatization.ResultsThe mass concentration of sulfide ion in blood had good linearity in the range of 0.2-40μg/m L w ith a limit of detection（LOD）of 0.05μg/m L.The mass concentration of sulfide ion was less than 0.05μg/m L in blank blood from different sources such as healthy subjects and dead cases.In 3 sulfide poisoning cases,sulfide ion was detected in the blood samples of 6 victims,and the mass concentration range was 1.02-3.13μg/m L.ConclusionThis study establishes a method for investigation of sulfide ion in blood which has been applied successfully to the cases of fatal sulfide poisonings.

forensic toxicology;poisoning;hydrogen sulfide;derivatization;gas chromatography-mass spectrometry

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.008

1004-5619（2017）02-0148-06

2016-08-01）

（本文編輯：嚴慧）

十三五國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFC0800704）；上海市科委資助項目（15dz1207500）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺資助項目（16DZ2290900）

強火生（1991—），男，碩士研究生，主要從事藥物分析研究；E-mail：13818940774@163.com

向平，女，研究員，主要從事法醫(yī)毒物學研究和鑒定；E-mail：xiangp@ssfjd.cn