華夏TM白金PCR 擴增試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估

王亞麗，盛翔，李敏，陳玉玲，林源，陳麗琴

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；4.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325000；5.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

·論著·

華夏TM白金PCR 擴增試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估

王亞麗1，2，盛翔2，3，李敏2，4，陳玉玲2，5，林源2，陳麗琴1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；4.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325000；5.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

目的調(diào)查華夏TM白金PCR擴增試劑盒所包含的23個常染色體STR基因座在中國漢族人群中的遺傳多態(tài)性，評估其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用價值。方法應(yīng)用華夏TM白金PCR擴增試劑盒對500名漢族無關(guān)健康個體進行分型檢測，統(tǒng)計分析所含STR基因座的頻率分布及群體遺傳學(xué)參數(shù)，與目前國內(nèi)外常用的7種商品化試劑盒在STR基因座個數(shù)、內(nèi)標、熒光標記、Ladder中等位基因總數(shù)以及系統(tǒng)效能上進行比較。結(jié)果23個常染色體STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），個體識別率為0.791 5～0.986 2，多態(tài)信息含量為0.559 0～0.914 0。系統(tǒng)累積個體識別率高達1-4.1×10-28，三聯(lián)體累積非父排除率為1-4.1×10-10，二聯(lián)體累積非父排除率為1-8.4×10-7。通過與7種試劑盒比較，華夏TM白金PCR擴增試劑盒含有的等位基因分型標準品（Ladder）中的等位基因數(shù)最多。結(jié)論23個常染色體STR基因座在漢族人群中有良好的遺傳多態(tài)性，可用于法醫(yī)遺傳學(xué)親權(quán)鑒定及個體識別。通過與其他常見的7種商業(yè)化STR檢測試劑盒比較，華夏TM白金PCR擴增試劑盒可進一步提供更為豐富的遺傳信息。

法醫(yī)遺傳學(xué)；短串聯(lián)重復(fù)序列；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；華夏TM白金PCR擴增試劑盒；漢族

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是核心序列為2～7個堿基組成的短串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)。20世紀90年代，STR基因座第一次在人類親權(quán)鑒定中作為一種重要的遺傳標記出現(xiàn)[1]。第一個STR復(fù)合擴增的試劑盒由英國的法庭科學(xué)服務(wù)部（Forensic Science Service，F(xiàn)SS）研制，包括TH01、vWA、FES/FPS和F13A1四個基因座[1]。隨著人類基因組計劃的完成，對染色體上STR基因座的篩選更為快速、方便，商業(yè)化的STR檢測試劑盒陸續(xù)出現(xiàn)。常用的商業(yè)化STR檢測試劑盒主要包括美國Thermo Fisher公司推出的Identifier、GlobalFiler以及針對中國人群設(shè)計的Sinofiler、華夏系列試劑盒等，美國Promega公司研發(fā)的PowerPlex系列試劑盒；國產(chǎn)試劑盒常用的有基點認知技術(shù)（北京）有限公司推出的Golden e ye系列試劑盒，公安部物證鑒定中心研制的Typer系列試劑盒，以及無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司推出的AGCU系列試劑盒等。

目前，華夏TM白金PCR擴增試劑盒是美國Thermo Fisher公司推出的新一代六色熒光STR檢測試劑盒，共包含25個基因座，其中涵蓋了美國聯(lián)邦調(diào)查局（Federal Bureau of Investigation，F(xiàn)BI）于2017年1月1日強制要求的CODIS全部核心基因座[2-4]，同時包含了我國公安部國家DNA數(shù)據(jù)庫常見的21個基因座。本研究通過對該試劑盒中所包含的23個常染色體STR基因座在漢族人群中的分布頻率、群體遺傳學(xué)參數(shù)和連鎖不平衡情況的調(diào)查，并與文獻中所獲取的國內(nèi)外7種常用商業(yè)化STR檢測試劑盒（Identifier、Sinofiler、GlobalFiler、PowerPlex 21、Golden e ye 20A、Typer 15 Plus、AGCU 17+1）的群體遺傳學(xué)參數(shù)進行比較，評估該試劑盒的法醫(yī)遺傳學(xué)應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究的樣本來源于500名中國漢族健康無關(guān)個體，其中男性250名，女性250名，均為FTA卡血樣。以上樣本的采集和使用均獲得志愿者的知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

華夏TM白金PCR擴增試劑盒、標準品007和GeneScanTM600 LIZ v2.0分子量內(nèi)標均購自美國Thermo Fisher公司。

0.5 mm/1.2mm孔徑打孔器購自美國Harris公司，9700型PCR擴增儀、3500xl型基因分析儀均購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 PCR擴增和STR分型

用0.5mm/1.2mm孔徑打孔器進行打孔取樣，血樣直接打入預(yù)先準備好的潔凈96孔反應(yīng)板底部。采用12.5μL標準反應(yīng)體系對23個常染色體STR基因座（D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、TH01、FGA、D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338和Penta D）和Amelogenin以及1個Y-InDel位點進行PCR擴增。體系組成包括反應(yīng)混合物5μL，引物組5μL，去離子水2.5μL。采用標準品007作為陽性對照。

PCR條件：95℃1min預(yù)變性；94℃3 s，59℃16 s，65℃29 s，27個循環(huán)；60℃5min；4℃保溫。加熱模式設(shè)為“Max”。擴增好的PCR產(chǎn)物變性后在3500xl型基因分析儀上進行毛細管電泳，用GeneMapper?ID-X軟件對STR基因座進行分型。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Modified-Powerstates[5]和Cervus v3.0.7[6]軟件對23個常染色體STR基因座進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，并完成等位基因分布頻率、個體識別率（DP）、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）及期望雜合度（He）的計算。采用Arlequin軟件完成STR基因座之間連鎖不平衡分析。參照文獻[7]公式計算三聯(lián)體非父排除率（PET）、二聯(lián)體非父排除率（PED）、三聯(lián)體累積非父排除率（CPET）、二聯(lián)體累積非父排除率（CPED）、累積個體識別率（CDP）。

通過查閱文獻資料[8-13]，得到國內(nèi)外常見的7種商業(yè)化STR檢測試劑盒的基本信息，并與華夏TM白金試劑盒在STR基因座個數(shù)、內(nèi)標、熒光標記、Ladder中等位基因總數(shù)以及系統(tǒng)效能（CPE和CDP值）上進行比較。

2 結(jié)果

2.1 基因分型及等位基因分布情況

華夏TM白金PCR擴增試劑盒推薦的PCR擴增體系為25μL，在本研究中，嘗試采用12.5μL的擴增體積對標準品007進行PCR擴增和電泳檢測，電泳分型圖譜準確。

23個常染色體STR基因座的基本遺傳信息見表1，試劑盒中分型標準物圖譜見圖1，其中含有等位基因數(shù)為356個。本次在500名個體中共檢出279個等位基因，其中Penta E檢出的最多，為23個，TPOX和TH01最少，均為6個，等位基因頻率分布見表2。

2.2 群體遺傳學(xué)參數(shù)

經(jīng)χ2檢驗，500名中國漢族健康無關(guān)個體在23個STR基因座上均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05）。群體遺傳學(xué)參數(shù)見表3，其中DP為0.7915～0.9862，PIC為0.5590～0.9140，Ho為0.6214～0.920 6，PET為0.360 4～0.837 1。經(jīng)Arlequin軟件分析，各STR基因座之間相互獨立，采用乘積原則計算，CPET為1-4.1×10-10，CPED為1-8.4×10-7。

2.3 商業(yè)化STR檢測試劑盒系統(tǒng)效能比較

8個商業(yè)化STR檢測試劑盒的STR基因座個數(shù)、內(nèi)標、熒光標記、Ladder中等位基因總數(shù)見表4。各試劑盒的系統(tǒng)效能比較見表5，其中華夏TM白金試劑盒的CPE值和CDP值最高，分別為1-4.1×10-10和1-4.1×10-28。Identifier試劑盒的CPE值和CDP值最低，分別為1-1.3×10-6和1-1.5×10-17。

表1 華夏TM白金PCR擴增試劑盒中23個STR基因座的基本遺傳信息

圖1 華夏TM白金PCR擴增試劑盒中等位基因分型標準物圖譜

表2 23個常染色體STR基因座的等位基因頻率分布（n=500）

續(xù)表2

表3 23個常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)（n=500）

表4 8種常見商業(yè)化STR檢測試劑盒的基本信息

表5 8種常見商業(yè)化STR檢測試劑盒的系統(tǒng)效能對比

3 討論

目前，國內(nèi)外常用的商業(yè)化STR檢測試劑盒有多種，其中美國Thermo Fisher公司先后推出的采用五色熒光技術(shù)的Identifier和Sinofiler試劑盒在中國市場應(yīng)用廣泛，均包含15個常染色體STR基因座和Amelogenin，其不同之處在于Sinofiler試劑盒是針對中國人群開發(fā)，將Identifier試劑盒中在中國人群中鑒別能力較差、多態(tài)性較低的TPOX和TH01兩個基因座替換成D12S391和D6S1043[14]。2012年Thermo Fisher公司推出突破性六色熒光標記技術(shù)、含有24個STR基因座的GlobalFiler PCR擴增試劑盒，其中包含F(xiàn)BI最新公布的20個CODIS核心基因座［即1997年FBI建立的13個CODIS基因座（CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA）以及增加的7個基因座（D1S1656、D2S441、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433、D22S1045）］。同年，美國Promega公司也推出了PowerPlex 21試劑盒，該試劑盒整合了Identifier、Sinofiler以及PowerPlex 16三種試劑盒所包含的全部STR基因座，再加上D1S1656，即13個CODIS核心基因座加上D1S1656、D2S1338、D12S391、D19S433、D6S1043、Penta E和Penta D這7個STR基因座。國產(chǎn)化試劑盒Golden e ye 20A是基點認知技術(shù)（北京）有限公司研發(fā)的一款試劑盒，與PowerPlex 21試劑盒相比，減少了1個STR基因座D1S1656。Typer 15 Plus試劑盒是由公安部物證鑒定中心研制推行，其在Typer 15的基礎(chǔ)上又增加了4個基因座（TH01、TPOX、D12S391、D19S433），該試劑盒既保留了足夠的通用STR基因座，便于DNA數(shù)據(jù)的交流和共享，同時選擇了更適合中國人群的一些新的基因座，大大提高了其實用性?？蓪?8個基因座進行同步擴增的AGCU 17+1試劑盒是由無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司研發(fā)，其在Typer 15的基礎(chǔ)上少了1個基因座D12S391。本研究中的華夏TM白金PCR擴增試劑盒是美國Thermo Fisher公司針對中國人群開發(fā)的試劑盒，在GlobalFiler試劑盒的基礎(chǔ)上增加了在中國人群中多態(tài)性高的D6S1043、Penta E和Penta D，刪掉了SE33和DYS391兩個基因座。

Gill等[15]認為DP＞0.9、H＞0.7是高度鑒別能力的基因座。人類基因定位第11次國際會議標準[16]指出，PIC≥0.6屬于高多態(tài)性基因座。本次檢測數(shù)據(jù)表明，除D3S1358、CSF1PO、TPOX和TH01基因座外，其余基因座DP值均大于0.9；除TPOX外，其余基因座PIC值均大于0.6；除D3S1358、TPOX、TH01外，其余基因座PET值均在0.5以上；除TPOX和TH01外，其余基因座Ho均大于0.7。以上統(tǒng)計結(jié)果顯示，Penta E的DP（0.9862）、PIC（0.9140）、PET（0.8371）、Ho（0.9206）值均最高，TH01、TPOX的效能最低，這與文獻[8]中提到的TH01、TPOX在中國人群中的多態(tài)性較差相符合。

當分型標準品的基因座等位基因未包含檢測樣本的等位基因時，則表示出現(xiàn)新的等位基因，需要自己定義，在實踐中稱這些為“off-ladder”等位基因或“OL”基因[1]，即稀有等位基因。其包括兩種情況[17]，一種是在基因座Ladder最大和最小等位基因內(nèi)，另一種是超過基因座Ladder范圍位于兩個鄰近基因座Ladder之間。因此，Ladder中等位基因分型的完善，意味著該試劑盒在自動分型上更全面、準確、方便。由于華夏TM白金PCR擴增試劑盒是在GlobalFiler試劑盒基礎(chǔ)上研發(fā)的，在重疊的21個基因座中，這兩個試劑盒中Ladder的等位基因分型一致。綜合分析8種商業(yè)化試劑盒，其中PowerPlex 21試劑盒在D1S1656、D5SD818、D6S1043、D7S820、D13S317、D16S539、TPOX、TH01、FGA、D12S391、D21S11、vWA以及CSF1PO基因座所含有的等位基因最為豐富；Goldene ye 20A試劑盒在Penta E、D12S391、D21S11、vWA基因座以及Typer 15 Plus試劑盒在D19S433基因座的等位基因分型最全面。

本研究中共發(fā)現(xiàn)11個稀有等位基因，包括Penta E（17.4，19.4，25）、D19S433（11.2，14.3）、FGA（24.1）、D6S1043（17.3，18.2，22.3）、D1S1656（15.1）、D12S391（18.3）。其中，除D6S1043基因座外，其余5個基因座發(fā)現(xiàn)的稀有等位基因均已在STRBase網(wǎng)站[18]公布的相關(guān)STR基因座的“off-ladder”中有報道。D6S1043基因座的三種稀有等位基因均在國內(nèi)文獻[19-22]中有報道，其中湖南漢族[19]和廣東漢族[20]均發(fā)現(xiàn)這三種稀有等位基因，在浙江漢族[21]和云南漢族[22]中，除等位基因17.3外，其余兩種稀有等位基因也均有發(fā)現(xiàn)。若要發(fā)現(xiàn)更多的稀有等位基因，無疑需要增加群體數(shù)量。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在“off-ladder”等位基因中，Penta E的等位基因26，D2S441的等位基因9.3、10.3、12.3及13.3，F(xiàn)GA的等位基因21.2、22.2、23.2及24.2，D7S820的等位基因9.1，D6S1043的等位基因18，D1S1656的等位基因18，按照1/1000的標準[23]，以上“off-ladder”等位基因均不屬于稀有等位基因。綜上，華夏TM白金PCR擴增試劑盒在Ladder設(shè)計上可以進一步完善。

在本研究所比較的8種商業(yè)化STR檢測試劑盒中，華夏TM白金PCR擴增試劑盒含有的基因座個數(shù)最多（25個），Sinofiler和Identifier試劑盒所含個數(shù)最少（16個）。本研究通過參數(shù)CPE和CDP比較8種商業(yè)化STR檢測試劑盒的系統(tǒng)效能，其中，Identifier試劑盒的CPE和CDP值最低，華夏TM白金PCR擴增試劑盒的CPE和CDP值最高。這一數(shù)據(jù)與試劑盒中所包含的STR基因座及基因座個數(shù)相關(guān)。

結(jié)果表明，華夏TM白金PCR擴增試劑盒中的23個常染色體STR基因座在中國漢族人群中具有高度遺傳多態(tài)性，與上述7種常用的商業(yè)化STR檢測試劑盒相比，具有更高的親權(quán)鑒定能力和個體識別能力。

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Forensic App lication of HuaxiaTMPlatinum Kit

WANG Ya-li1,2,SHENG Xiang2,3,LIMin2,4,CHEN Yu-ling2,5,LIN Yuan2,CHEN Li-qin1
（1.Department of Forensic Medicine,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science, Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China;3.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;4.School of Basic Medical Sciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China;5.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,School of Biotechnology, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China）

ObjectiveTo investigate the genetic polymorphism of 23 autosomal STR loci of HuaxiaTMPlatinum kit in Chinese Han population,and to evaluate the forensic efficiency of HuaxiaTMPlatinum kit.MethodsA total of 500 unrelated healthy individuals from Han population were genotyped w ith HuaxiaTMPlatinum kit.The frequency distribution and the parameter of population genetics of STR loci were analysed statistically.HuaxiaTMPlatinum kit was compared w ith other 7 commercial STR kits commonly seen at home and abroad in the number of STR loci,interior label,fluorescent mark,total number of alleles in Ladder and system effectiveness.ResultsAll the 23 autosomal STR loci were consistent w ith Hardy-Weinberg equilibrium（P＞0.05）.The discrim ination power was 0.791 5-0.9862.The polymorphism information content（PIC）was 0.559 0-0.914 0.The combined discrimination power（CDP）was 1-4.1×10-28, while combined probability of paternity exclusion in trio（CPET）and in duo（CPED）were 1-4.1×10-10and 1-8.4×10-7,respectively.Compared w ith other 7 kits,HuaxiaTMPlatinum kit contained the most number of alleles w ithin the Ladder.ConclusionAll the 23 autosomal STR loci of HuaxiaTMPlatinum kit w ith highly polymorphic in Han population can be used for paternity testing and individual identification. Compared w ith other 7 kits,it appears that HuaxiaTMPlatinum kit can provide more genetic inform ation.

forensic genetics;short tandem repeat;polymorphism,genetic;HuaxiaTMPlatinum kit;Han nationality

DF795.2

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.005

1004-5619（2017）02-0129-07

2016-09-27）

（本文編輯：張素華）

十三五國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFC0800703）；上海市科委標準研制項目（16DZ0501600）；上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項目（16DZ2290900）

王亞麗（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：1014762036@qq.com

陳麗琴，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)和法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：lqchenyj@163.com

通信作者：林源，男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：liny@ssfjd.cn