大鼠肌肉揮發(fā)性有機化合物變化規(guī)律與死亡時間的關(guān)系

劉蓓蓓，夏志遠，馬錦琦，李樸，呂坪，周海梅

（河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003）

·論著·

大鼠肌肉揮發(fā)性有機化合物變化規(guī)律與死亡時間的關(guān)系

劉蓓蓓，夏志遠，馬錦琦，李樸，呂坪，周海梅

（河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003）

目的探究大鼠死后肌肉揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compound，VOC）的變化規(guī)律與死亡時間（postmortem interval，PMI）的關(guān)系。方法健康大鼠120只，隨機分成12組，每組10只，以頸椎脫臼方式處死后保存在（25±1）℃環(huán)境中，在死后即刻（0d）、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10d共12個時間點分別取一組大鼠肌肉，采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法收集、檢測、分析大鼠肌肉VOC。結(jié)果共鑒定出15種VOC，其中芳香類9種、含硫類3種、脂肪酸類2種、雜環(huán)類1種。隨PMI延長，VOC種類總數(shù)呈增加趨勢，第1天沒有檢測到VOC，第2天檢出3種，第3天檢出9種，第4天檢出11種，5～7 d檢出14種，8～10d檢出15種。不同VOC峰面積與PMI存在一定的相關(guān)性（校準R2=0.15～0.96），15種VOC總峰面積（y）與PMI（x）相關(guān)：2～5d，回歸方程為y=-17.05x2+164.36x-246.36（校準R2=0.96）；6～10d回歸方程為y=2.24x+101.13（校準R2=0.97）。結(jié)論肌肉VOC變化規(guī)律有助于PMI的推斷。

法醫(yī)病理學(xué)；揮發(fā)性有機化合物；氣相色譜-質(zhì)譜法；固相微萃??；死亡時間；??；大鼠

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的難點問題之一，尋找客觀、準確的PMI推斷方法是法醫(yī)學(xué)者的重要任務(wù)。目前，利用尸體組織內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等時序性變化規(guī)律及昆蟲數(shù)據(jù)推斷PMI，是當前研究的熱點[1，2]。然而，尸體腐敗影響因素較多，組織內(nèi)成分復(fù)雜，尋找更多的研究指標和方法，是最終建立多指標、多因素PMI推斷模型的重要基礎(chǔ)。

隨著各種大型精密分析儀器的發(fā)明和使用，對各種化學(xué)成分進行定性、定量檢測已經(jīng)成為可能，其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）可以實現(xiàn)對復(fù)雜有機化學(xué)組分進行有效的分離、定性及定量檢測，因此已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于毒（藥）物成分的檢測、中藥成分的分析、食品特征風(fēng)味成分的研究等領(lǐng)域。法醫(yī)學(xué)研究表明，機體死亡后，尸體組織中的蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等大分子物質(zhì)在細菌和酶的作用下，會產(chǎn)生大量可以被GC-MS檢測到的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compound，VOC），如芳香類、含有機硫類、有機酸、酯、醛、酮類等成分，由于一些特征VOC通常由尸體腐敗分解而來，因此VOC的檢測常用于確定或提示隱匿尸體的埋藏地點[3，4]。而食品科學(xué)研究數(shù)據(jù)表明，肉組織中產(chǎn)生的VOC與肉的放置時間存在顯著的相關(guān)性，即隨著存放時間的延長，肉組織中VOC的種類和含量將會持續(xù)增加[5-8]。因此，食品科學(xué)可以通過檢測肉類的VOC來鑒定肉類的新鮮程度。

尸體肌肉的腐敗與食品肉類變質(zhì)機制相似，因此尸體肌肉VOC的時序性變化有可能成為PMI推斷的另一種方法。本研究利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法（head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）提取、檢測、分析恒溫下不同PMI大鼠肌肉VOC種類和含量變化，初步探究尸體肌肉VOC的產(chǎn)生與變化規(guī)律及其與PMI的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設(shè)備

GC-MS（HP6890A-5973N，美國Agilent公司），萃取纖維頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS，美國SUPELCO公司），電子分析天平（OHAUSDiscovery，美國OHAUS公司）。

1.2 實驗動物分組與處理

健康SD大鼠120只，雌雄不限，體質(zhì)量（240± 30）g，隨機分成12組，每組10只。以頸椎脫臼方式處死大鼠，大鼠放置于泡沫箱內(nèi)，用薄層透氣絲綢封口。將裝有大鼠的泡沫箱放置于溫度（25±1）℃、濕度（45±5）%環(huán)境下保存。于死后即刻（0 d）、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d分別取一組大鼠進行操作。

1.3 肌肉VOC提取與檢測

1.3.1 HS-SPME

取每只大鼠后肢肌肉，去除脂肪和筋膜，并精確稱取2.000g，剪碎后移入50mL頂空瓶內(nèi)。將頂空瓶置于55℃中水浴并平衡20min后，將老化后的萃取纖維頭插入頂空瓶內(nèi)（插入長度4 cm），在55℃下吸附20min。將纖維頭收回，插入GC-MS進樣口，解析2min，對萃取成分進行檢測分析。進行下一次樣本檢測前，纖維頭在進樣口內(nèi)250℃解析10min，以消除不同樣品產(chǎn)物之間的影響。

1.3.2 GC-MS分析

GC條件色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱。升溫程序設(shè)置為起始溫度45℃，以10℃/min升溫至85℃，再以5℃/min升溫至130℃；以2.5℃/min升溫至135℃；再以10℃/min升溫至230℃，保持8min。進樣口溫度250℃，載氣（He）流速1.0mL/min，進樣方式選擇不分流。解析時間為2min。

MS條件：EI源能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度250℃，掃描范圍15～380amu。

定性和定量分析：通過NIST譜庫結(jié)合人工解析確定每種VOC的名稱、分子式及分子量。采用手動積分方法進行峰面積計算，以3次計算結(jié)果平均值作為該物質(zhì)峰面積最終結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以PMI為自變量（x），以每種VOC為因變量（y），分析不同種VOC與PMI的相關(guān)性；繪制VOC種類總數(shù)隨PMI變化的關(guān)系圖。以PMI為自變量（x），15種VOC總峰面積為因變量（y），分析VOC總峰面積與PMI的相關(guān)性。繪圖及分析過程均由OriginPro 8.0（美國OriginLab公司）完成。

2 結(jié)果

25℃環(huán)境下，大鼠死后10 d內(nèi)，共檢出15種VOC，結(jié)果見表1，其中芳香類9種，包括苯甲醛、苯酚、對甲基苯酚、苯乙胺、苯乙醇、吲哚、苯丙酸乙酯、3-甲基吲哚和苯亞甲基苯乙胺；含硫類3種，包括二甲基二硫、二甲基三硫和epsilon-硫代己內(nèi)酰胺；小分子脂肪酸類2種，分別為丁酸和4-甲基戊酸；雜環(huán)類1種，為2-哌啶酮。15種VOC中，吲哚、對甲基苯酚、二甲基二硫、二甲基三硫及2-哌啶酮平均峰面積較大，說明這幾種物質(zhì)含量相對較高。

芳香族VOC峰面積隨PMI變化見表2，其中吲哚、對甲基苯酚從第2天開始出現(xiàn)，苯甲醛、苯乙醇、苯丙酸乙酯從第3天開始出現(xiàn)，苯酚第4天開始出現(xiàn)，3-甲基吲哚、苯亞甲基苯乙胺第5天開始出現(xiàn)，苯乙胺第8天開始出現(xiàn)?？傮w而言，芳香類VOC種類逐漸增多。

其他類VOC峰面積隨PMI變化見表3。二甲基三硫第2天開始出現(xiàn)，二甲基二硫、4-甲基戊酸、2-哌啶酮第3天開始出現(xiàn)，丁酸第4天開始出現(xiàn)，epsilon-硫代己內(nèi)酰胺第5天開始出現(xiàn)。

15種VOC峰面積隨PMI回歸方程結(jié)果如表4，校準R2在0.15～0.96。

大鼠死后肌肉VOC種類變化與PMI的關(guān)系結(jié)果如圖1，1d內(nèi)無VOC，2～5d VOC種類顯著增多，6～10d VOC種類也有增加，但增加數(shù)目較上一階段少。

大鼠死后肌肉15種VOC總峰面積（y）隨PMI（x）變化如下：2～5 d總峰面積日增加量為3.5×106左右，二者的回歸方程為y=-17.05x2+164.36 x-246.36，校準R2=0.96；6～10 d總峰面積日增加量為1.0×106左右，二者關(guān)系的回歸方程為y=2.24x+101.13，校準R2=0.97。

表1 大鼠死后肌肉VOC總表

表2 芳香類VOC峰面積隨PMI變化（n=10，±s，×105）

表2 芳香類VOC峰面積隨PMI變化（n=10，±s，×105）

注：“-”表示未檢出

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表3 其他類VOC峰面積隨PMI變化（n=10，±s，×105）

表3 其他類VOC峰面積隨PMI變化（n=10，±s，×105）

注：“-”表示未檢出

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表4 不同種VOC峰面積（y）隨PMI（x）變化的回歸方程

圖1 大鼠肌肉VOC種類變化與PMI的關(guān)系

3 討論

目前，利用各種精密儀器檢測尸體組織內(nèi)大分子物質(zhì)含量的時間依賴性變化規(guī)律，是PMI推斷研究的熱點方法之一[9-11]。GC-MS具有高分辨率和高靈敏度，可以實現(xiàn)對復(fù)雜組分的分離和鑒定。而HS-SPME是集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的無需溶劑的樣品微萃取技術(shù)，具有操作簡單、便于攜帶、萃取率高等特點，是樣品前處理最先進的技術(shù)之一。因此，將HSSPME與GC-MS聯(lián)用，在分析尸體腐敗后組織VOC變化方面具有一定的優(yōu)勢。

食品肉類VOC變化規(guī)律與放置時間的相關(guān)性已經(jīng)初步得到證實。一般認為，這些VOC主要是組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的降解產(chǎn)物，芳香類及含氮、含硫物質(zhì)多為蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生，而有機酸、醛、酮、酯類多與脂肪和糖類降解有關(guān)[12]。微生物學(xué)進一步研究[13，14]表明，VOC種類與菌屬之間存在著一定的對應(yīng)關(guān)系，不同的VOC提示有不同菌種的存在，如吲哚提示有大腸埃希菌的存在，二甲基三硫提示有綠膿桿菌和金黃葡萄球菌的存在，丁酸則提示有葡萄球菌的存在等。從這一角度，肉類VOC種類的變化，理論上與優(yōu)勢菌群變化（或細菌群落演替）有關(guān)，而細菌群落的變化又與肉組織內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗、pH值改變、代謝物質(zhì)的積累等因素有關(guān)。

本研究利用HS-SPME-GC-MS法檢測了25℃下不同PMI大鼠肌肉的VOC?？紤]到脂肪液化較快及后期定量困難等問題，本實驗僅以肌肉組織作為研究對象。本實驗將大鼠放置于用透氣絲綢封口的泡沫箱內(nèi)，以消除蠅蛆等昆蟲代謝產(chǎn)物對檢測結(jié)果的干擾。將大鼠肌肉剪碎、適當提高平衡溫度，可以加快氣體揮發(fā)的速度，從而提高了檢測效率。選擇復(fù)合型纖維頭（50/30μm DVB/CAR/PDMS），主要考慮其可以萃取較寬分子量范圍的組分，且該種纖維頭所得結(jié)果具有重現(xiàn)性高、變異系數(shù)低等優(yōu)點。同時，實驗過程中，嚴格控制了平衡溫度、平衡時間、萃取時間、解析時間及萃取頭洗滌時間等，以保證實驗結(jié)果的可靠性。

本研究共鑒定出15種特征性VOC，與日本學(xué)者[15]所研究的豬死后體表VOC種類數(shù)目相比，本實驗除了檢測到相同種類的硫醚類物質(zhì)外，還檢測到更多種類的芳香類物質(zhì)，如3-甲基吲哚、苯丙酸乙酯、苯亞甲基苯乙胺等，但檢測到的酸、酮、醇類物質(zhì)較少。出現(xiàn)上述差異的可能原因是，本實驗沒有將脂肪作為研究對象，從而所檢測到的脂肪降解產(chǎn)物酸、醇、酮類物質(zhì)較少。而檢測到較多的芳香類VOC則與本實驗中肌肉的前處理方法及萃取方式有關(guān)。與食品科學(xué)肉類腐敗VOC相比，本實驗VOC種類檢測結(jié)果有一定差異。造成這種差異可能原因有，食品肌肉暴露于有氧環(huán)境中，受外界環(huán)境細菌影響較大，而尸體肌肉受皮膚保護，則處于相對無氧環(huán)境，細菌多來源于腸道。此外，檢測結(jié)果也與萃取方法等因素有關(guān)。

本研究表明，大鼠肌肉VOC變化與PMI存在一定的相關(guān)性。首先，每一種VOC與不同PMI區(qū)段相對應(yīng)，而結(jié)合所有種類VOC變化可將PMI區(qū)段進一步劃分。第二，不同種類VOC峰面積與PMI均有一定的相關(guān)性（校準R2=0.15～0.96），但通過15種VOC總峰面積推斷PMI推斷更有優(yōu)勢（校準R2=0.96～0.97）。然而，綜合運用VOC總峰面積和種類總數(shù)的變化規(guī)律推斷PMI結(jié)果更有意義。具體來說，大鼠死后肌肉VOC的種類數(shù)和總峰面積隨PMI延長均呈現(xiàn)階段性變化規(guī)律：1 d內(nèi)，未檢測到VOC；2～5 d，VOC種類總數(shù)隨PMI快速增加，峰面積日增加量較大（3.5×106左右）；6～10 d，VOC種類數(shù)隨PMI增加速度變慢，峰面積日增加量變?。?.0×106左右）。而大鼠肌肉VOC的階段性變化規(guī)律，與微生物學(xué)細菌總數(shù)生長曲線規(guī)律、法醫(yī)學(xué)尸體腐敗大致分期以及大鼠死后肌肉揮發(fā)性鹽基總氮（TVB-N）含量等變化規(guī)律基本一致[16，17]。傳統(tǒng)涉及多個分子指標的PMI研究中，當指標不能進行多元線性回歸時，常無法給出多個指標的回歸方程。而本研究采取了將指標種類（VOC種類）改變與指標總含量（VOC總峰面積）變化相結(jié)合的PMI推斷方法，初步給出了依據(jù)多指標的PMI推斷模型。因此，該法對于其他多分子指標的PMI研究也具有一定的借鑒意義。

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Relationship between the Change Rules of Volatile Organic Com pounds in Rat M uscle and Postmortem Interval

LIU Bei-bei,XIA Zhi-yuan,MA Jin-qi,LI Pu,LüPing,ZHOU Hai-mei
（School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）

ObjectiveTo explore the relationship between the change rules of volatile organic compounds（VOCs）in rat muscle and postmortem interval（PM I）.MethodsA total of 120 healthy rats were divided random ly into 12 groups（10 for each group）.After the rats were sacrificed by cervical dislocation,the bodies were kept at（25±1）℃.Ratmuscle samples were separately obtained at 12 PM I points,including 0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9 and 10 d.The VOCs in rat muscles were collected,detected and analyzed by headspace solid-phase m icroextraction（HS-SPME）coupled to gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）.ResultsIn total,15 species of VOCs were identified,including 9 aromatic compounds,3 sulfur compounds,2 aliphatic acids and 1 heterocyclic compound.The species of VOCs increased w ith PM I：no species were detected w ithin 1 day,3 species were detected on day 2,9 on day 3,11 on day 4,14 from day 5 to 7,and 15 from day 8 to 10.Total peak area of 15 species of VOCs was significantly correlated to PM I（adjusted R2=0.15-0.96）：the regression function was y=-17.05 x2+ 164.36 x-246.36（adjusted R2=0.96）from day 2 to 5,and y=2.24 x+101.13（adjusted R2=0.97）from day 6 to 10.ConclusionThe change rules of VOCs in rat muscle are helpful for PM I estimation.

forensic pathology;volatile organic compounds;gas chromatography-mass spectrometry;solid phase m icroextraction;postmortem interval;muscles;rats

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.003

1004-5619（2017）02-0120-05

2016-01-27）

（本文編輯：鄒冬華）

河南省教育廳重點科研基金資助項目（16A150030）；河南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項目（CXJJ-ZR22）

劉蓓蓓（1989—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒物分析的研究；E-mail：legal-medicine@qq.com

周海梅，女，教授，主要從事法醫(yī)毒物分析教學(xué)與研究；E-mail：lyzhouhm@haust.edu.cn