窖蛋白基因變異及多態(tài)性與不明原因猝死的相關(guān)性

午方宇，唐新華，蓋連磊，孔小平，郝博，黃二文，石河，盛立會，權(quán)力，劉水平，羅斌

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500；3.廣州市公安局黃埔區(qū)分局，廣東廣州 510530；4.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東廣州 511430；5.廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510030；6.深圳市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東深圳 518008）

·論著·

窖蛋白基因變異及多態(tài)性與不明原因猝死的相關(guān)性

午方宇1，唐新華2，蓋連磊3，孔小平4，郝博1，黃二文1，石河5，盛立會6，權(quán)力1，劉水平1，羅斌1

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500；3.廣州市公安局黃埔區(qū)分局，廣東廣州 510530；4.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東廣州 511430；5.廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510030；6.深圳市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東深圳 518008）

目的尋求窖蛋白（caveolin，CAV）基因變異位點，探討其與不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD）的相關(guān)性。方法收集SUD組（71例）、冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）組（62例）和對照組（60例）血樣，分別提取基因組DNA，采用PCR方法擴增CAV1與CAV3基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子拼接區(qū)，進行直接測序，以明確CAV基因的遺傳變異類型，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果在SUD組中共檢測到4個可能有意義的變異位點，其中2個為新發(fā)現(xiàn)的突變位點，分別為CAV1：c.45C＞T（T15T）和CAV1：c.512G＞A（R171H）；2個為SNP位點，分別為CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642），且這兩個SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率在SUD組與對照組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在CAD組中均未發(fā)現(xiàn)上述變異位點。結(jié)論部分SUD可能與CAV1和CAV3基因變異存在一定相關(guān)性。

法醫(yī)病理學(xué)；法醫(yī)遺傳學(xué)；猝死，心臟；不明原因猝死；窖蛋白；基因突變；單核苷酸多態(tài)性

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是指因心臟受到各種因素作用導(dǎo)致的、出現(xiàn)在1h之內(nèi)的非暴力死亡，其發(fā)生往往難以預(yù)料[1]。SCD患者主要分為兩大類，第一類為解剖陽性，占SCD的絕大多數(shù)，該類SCD死者經(jīng)過法醫(yī)學(xué)尸體解剖通?？蓹z見冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）[2，3]；第二類為解剖陰性，歸類為不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD），該類患者經(jīng)全面的尸體解剖以及組織病理學(xué)檢驗、毒物檢驗等均未能發(fā)現(xiàn)明確死因[4]。當(dāng)前，有研究[5-8]表明，離子通道病如長QT綜合征（long QT syndrome，LQTS）、Brugada綜合征、兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速（catecholaminergic polymorphicventricular tachycardia，CPVT）等引起的惡性心律失常可能成為導(dǎo)致SUD的主要原因之一。目前已發(fā)現(xiàn)50多種基因突變與離子通道病有關(guān)[9-11]，包括SCN5A、KCNQ1、NOS1AP等。窖蛋白（caveolin，CAV）作為胞膜窖的結(jié)構(gòu)蛋白，其腳手架結(jié)構(gòu)域可與多種心肌離子通道相結(jié)合并調(diào)控其功能，包括SCN5A編碼的電壓門控鈉通道（Nav1.5）、KCNH2編碼的電壓依賴性鉀通道（Kv11.1）[12，13]等。部分研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，CAV基因發(fā)生突變可導(dǎo)致心肌鈉通道及鉀通道功能紊亂，影響心肌動作電位的產(chǎn)生，從而誘發(fā)惡性心律失常甚至猝死。

本研究選取SUD病例及CAD猝死病例為研究對象，篩查CAV基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子拼接區(qū)的突變位點，以期發(fā)現(xiàn)SUD與CAV基因的相關(guān)性，為該類猝死案件分子學(xué)死亡機制的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室2009—2016年受理的71例SUD者的心血樣本作為SUD組，其中男性53例，女性18例，平均年齡（34.2± 8.4）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)[17]：（1）平素體健，生前無重大疾病史；（2）死亡迅速（大多數(shù)從發(fā)病到死亡在1h之內(nèi)）；（3）死亡時處于一般日?；顒踊蛩郀顟B(tài)；（4）死后經(jīng)系統(tǒng)法醫(yī)學(xué)尸體解剖及組織病理學(xué)檢驗未發(fā)現(xiàn)明確死因；（5）毒物檢驗未檢出常見毒（藥）物成分。由于部分血樣中DNA降解，故部分多態(tài)性位點的實驗組例數(shù)可能存在與樣本總數(shù)不一致的情況。

收集中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室2009—2016年受理的62例CAD猝死者心血樣本作為CAD組，其中男性40例，女性22例，平均年齡（41.3±9.4）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)[18]：（1）死亡迅速（大多數(shù)從發(fā)病到死亡在1h之內(nèi)）；（2）左、右冠狀動脈分支狹窄在75%以上；（3）未發(fā)現(xiàn)其他致死性損傷、疾病及中毒。

收集中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室2009—2016年受理的60例死因明確且排除心源性疾病致死的案例，采其心血樣本作為對照組，其中男性48例，女性12例，平均年齡（38.6±12.6）歲。該組死因主要為機械性損傷、機械性窒息、非心臟性致死性疾病和中毒。

1.2 DNA提取、目的片段PCR擴增及產(chǎn)物測序

使用血樣基因組DNA磁珠法提取試劑盒（長春市博坤生物科技有限公司）于DNA自動化提取工作站（煙臺澳斯邦生物工程有限公司）從SUD組、CAD組及對照組心血白細(xì)胞中提取DNA。

根據(jù)GeneBank已知人類CAV1及CAV3的基因序列（NG_012051、NG_008797），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物（表1～2），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物。

表1 CAV1基因PCR擴增區(qū)域及相應(yīng)引物

表2 CAV3基因PCR擴增區(qū)域及相應(yīng)引物

應(yīng)用PCR擴增方法對CAV1和CAV3基因編碼區(qū)以及外顯子-內(nèi)含子拼接區(qū)進行擴增。PCR反應(yīng)體系：GoTaq?Green反應(yīng)混合物（包括2×Green GoTaq?反應(yīng)緩沖液、400μmol/L dATP、400μmol/L dGTP、400μmol/L dCTP、400μmol/L dTTP和3mmol/L MgCl2，美國Promega公司）12.5μL，ddH2O 7.5μL，模板DNA溶液3μL（0.5 ng/μL）以及正向及反向引物各1μL（10μmol/L），共25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30 s，退火溫度（表1～2）40 s，72℃延伸55 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物的純化與直接測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，測序引物與PCR引物相同（表1～2）。

1.3 結(jié)果分析

使用DNAStar、SeqMan等分析軟件將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因cDNA序列進行比對分析。

發(fā)現(xiàn)的可疑突變位點均重新提取相關(guān)血樣DNA進行雙向測序驗證。如遇錯義突變，分析其編碼氨基酸的改變，并使用PolyPhen-2軟件預(yù)測其致病性。

對于發(fā)現(xiàn)的可疑單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，計算并比較各SNP位點在SUD組、CAD組及對照組中的基因型頻率及等位基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。基因型頻率=基因型個體數(shù)/該二倍體群體總數(shù)，等位基因頻率=（基因純合子個體數(shù)×2+基因雜合子個體數(shù)）/（群體總數(shù)×2）。

2 結(jié)果

2.1 CAV1與CAV3基因的突變檢測

對71例SUD組血樣的PCR產(chǎn)物進行直接測序，測序結(jié)果與CAV1及CAV3基因cDNA序列進行比對，共發(fā)現(xiàn)4個突變位點（表3），均位于CAV1基因，其中2個位點位于內(nèi)含子區(qū)（c.30+28C＞T；c.31-42C＞T），另外2個位點位于外顯子編碼區(qū)（c.45C＞T；c.512G＞A），其中c.45C＞T為同義突變，c.512G＞A為錯義突變。經(jīng)與NCBI基因數(shù)據(jù)庫中收錄基因突變比對后，證實上述位于外顯子編碼區(qū)的2個突變位點為新發(fā)現(xiàn)的突變位點。

表3 本研究發(fā)現(xiàn)的SUD組CAV1基因突變位點

CAV1基因內(nèi)含子區(qū)的突變位點對窖蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響可能性較小，故不予討論。CAV1基因外顯子編碼區(qū)第一個突變位點45C＞T在第31號病例中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在CAV1基因第二個外顯子，其基因型由CC變?yōu)镃T，但對應(yīng)的第15位氨基酸蘇氨酸并未發(fā)生改變，屬同義突變，即T15T（圖1A）；第二個突變位點512G＞A在第23號病例中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在CAV1基因第三個外顯子，其基因型由GG變?yōu)镚A，導(dǎo)致其編碼的第171位氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，屬錯義突變，即R171H（圖1B），使用PolyPhen-2等軟件預(yù)測該錯義突變導(dǎo)致氨基酸改變的致病性，證實該突變致病概率可能較高。在CAD組及對照組中均未發(fā)現(xiàn)上述突變。

圖1 CAV1基因中新發(fā)現(xiàn)突變在SUD組、CAD組及對照組的測序圖

2.2 CAV1與CAV3基因的多態(tài)位點檢測

對71例SUD組血樣的PCR產(chǎn)物進行直接測序，共發(fā)現(xiàn)8個SNP位點：CAV1：c.246C＞T（rs35242077）；CAV1：c.*328A＞G（rs34123906）；CAV1：c.*1186G＞A（rs577466219）；CAV3：c.-33G＞T（rs72546666）；CAV3： c.99C＞T（rs1008642）；CAV3：c.*645A＞T（rs11476）；CAV3：c.*783A＞G（rs7629329）；CAV3：c.*811C＞G（rs10882）。上述8個SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率在兩組人群的多態(tài)性分布詳見表4～11。其中CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642）位點的等位基因頻率和基因型頻率在SUD組和對照組中的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642）這兩個SNP位點分別位于CAV1、CAV3基因的外顯子編碼區(qū)，其堿基的改變對氨基酸的表達均未造成影響，屬于同義多態(tài)。

對CAD組血樣的PCR產(chǎn)物進行直接測序，結(jié)果顯示，上述8個SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率在CAD組與對照組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但上述SNP位點在SUD組和CAD組中基因型頻率及等位基因頻率的分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 CAV1基因中c.246C＞T位點（rs35242077）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表5 CAV1基因中c.*328A＞G位點（rs34123906）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表6 CAV1基因中c.*1186G＞A位點（rs577466219）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表7 CAV3基因中c.-33G＞T位點（rs72546666）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表8 CAV3基因中c.99C＞T位點（rs1008642）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表9 CAV3基因中c.*645A＞T位點（rs11476）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表10 CAV3基因中c.*783A＞G位點（rs7629329）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

表11 CAV3基因中c.*811C＞G位點（rs10882）的基因型頻率及等位基因頻率[n（%）]

3 討論

Vatta等[14]發(fā)現(xiàn)CAV3基因突變與Nav1.5共表達時，晚鈉電流即會增強，增強的晚鈉電流在動作電位時程中延長心肌復(fù)極化從而導(dǎo)致QT間期延長。故CAV基因可能為影響心臟電生理的重要基因，通過介導(dǎo)離子通道的功能而影響心肌細(xì)胞動作電位的改變，導(dǎo)致心室延遲復(fù)極、QT間期延長甚至致死性心律失常。

本研究對CAV1和CAV3基因在71例SUD組及60例對照組中進行序列對比篩查，在SUD組共發(fā)現(xiàn)2個位于外顯子編碼區(qū)的突變（T15T、R171H），經(jīng)與NCBI基因數(shù)據(jù)庫中收錄基因突變比對后，證實上述位于外顯子編碼區(qū)的2個突變位點為新發(fā)現(xiàn)的突變位點。T15T位于CAV1基因第二個外顯子，當(dāng)?shù)?5位等位基因C突變?yōu)門后，其編碼的第15位蘇氨酸未發(fā)生改變，屬同義突變。普遍認(rèn)為基因突變導(dǎo)致氨基酸序列改變可能會造成蛋白質(zhì)功能異常，而突變的核苷酸序列若無相應(yīng)氨基酸改變則認(rèn)為是無害的，不會影響蛋白質(zhì)的功能。但部分研究[19-21]表明，同義突變可能會影響轉(zhuǎn)錄時剪接的準(zhǔn)確性、翻譯的保真度以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能。故該同義突變亦可能對其編碼蛋白質(zhì)功能造成影響。R171H位于CAV1基因第三個外顯子，當(dāng)?shù)?12位等位基因G突變?yōu)锳后，其編碼的第171位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸，屬錯義突變。經(jīng)PolyPhen-2等蛋白質(zhì)預(yù)測軟件預(yù)測該突變的致病性，證實該突變致病概率可能較高。CAV1第171位氨基酸位于其羧基端，并不在其腳手架區(qū)域，但該區(qū)域可能在調(diào)控腳手架區(qū)域與離子通道結(jié)合中起作用，其致病機制仍需下一步進行功能研究予以證實。

除了上述突變位點外，本研究還在SUD組發(fā)現(xiàn)8個SNP位點，其中2個SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率在SUD組與對照組中的分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），分別位于CAV1（rs35242077）與CAV3（rs1008642）基因，提示rs35242077與rs1008642可能是SUD易感基因位點。第一個SNP位點rs35242077位于CAV1基因編碼的腳手架結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該區(qū)域包含與離子通道蛋白相結(jié)合的特異性位點，位于腳手架區(qū)域的部分位點發(fā)生變異，可能會影響與通道蛋白結(jié)合強度，進而導(dǎo)致離子通道功能的改變甚至心律失常的發(fā)生，據(jù)此推測rs35242077可能是SUD易感基因位點。第二個SNP位點rs1008642位于CAV3基因的第一個外顯子，在對照組T等位基因頻率，即最小等位基因頻率（mirror allele frequency，MAF）為0.450，而在SUD組MAF值則下降到0.261；對照組中，CC的基因型頻率為0.267，而在SUD組中，CC的基因型頻率則為0.577。該SNP位點等位基因頻率和基因型頻率在SUD組和對照組中差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示rs1008642位點可能為SUD易感基因位點，該位點的多態(tài)性分布可能與SUD存在一定的相關(guān)性。

Asker等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CAV1基因多態(tài)性T29107A、G14713A與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）有關(guān)，亦有文獻[23，24]證實部分OSAS患者心電圖呈現(xiàn)長QT表現(xiàn)，OSAS可能為SCD的一個重要因素。由于T29107A及G14713A均位于CAV1基因的內(nèi)含子區(qū)，本研究就CAV1基因外顯子編碼區(qū)及拼接區(qū)進行基因篩查，未對上述兩個內(nèi)含子區(qū)位點進行檢測，下一步研究將對CAV1基因內(nèi)含子區(qū)易感基因位點進行篩查。現(xiàn)有文獻報道[25]，CAV3基因部分突變位點如V82I、F97C、S141R可能與長QT綜合征9型（LQT9）有關(guān)，但本研究對71例SUD者進行CAV3基因檢測并未發(fā)現(xiàn)上述突變的發(fā)生，考慮可能為本研究樣本量較小所致，不排除擴大樣本量后將會出現(xiàn)相應(yīng)突變的改變。

本研究亦對62例CAD組CAV1和CAV3基因外顯子及拼接區(qū)進行測序，并未檢出可疑突變位點，且也未發(fā)現(xiàn)與對照組基因型或等位基因存在明顯差異的SNP位點。但SUD組中發(fā)現(xiàn)的部分SNP位點與CAD組對比，其基因型及等位基因頻率存在明顯差異。據(jù)此初步認(rèn)為SUD分子病因可能與CAD不同，目前大多數(shù)CAD者直接死因為急性缺血缺氧導(dǎo)致心功能障礙死亡，SUD者死因則更傾向于惡性心律失常所致。除CAD外，部分心肌?。ㄈ缰滦穆墒СＰ杂沂倚募〔。?、傳導(dǎo)系統(tǒng)疾?。ㄈ绮B(tài)竇房結(jié)綜合征）等也可能與某些離子通道基因或相關(guān)基因有關(guān)。本課題組下一步工作將對該類人群CAV1和CAV3基因進行檢測，以明確CAV1和CAV3基因變異與其他心源性疾病是否存在關(guān)聯(lián)性，即不同SCD者CAV1和CAV3基因的多態(tài)性分布是否存在差異。

本研究對中國人群SUD病例的CAV基因突變位點進行篩查，初步發(fā)現(xiàn)2個變異位點（CAV1：c.45C＞T和CAV1：c.512G＞A），而上述位點在對照組中未出現(xiàn)，考慮CAV基因突變可能與SUD的發(fā)生相關(guān)，上述位點有可能導(dǎo)致SUD的發(fā)生，但并不能排除為假陽性的表現(xiàn)。另外本研究在CAV1及CAV3基因中發(fā)現(xiàn)2個多態(tài)性位點（rs35242077、rs1008642），其在SUD組與對照組間的分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能為SUD易感基因位點，但其是否致病及相關(guān)致病機制仍需在后續(xù)研究中予以確認(rèn)。

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Correlation between Genetic Variants and Polym orphism of Caveolin and Sudden Unexplained Death

WU Fang-yu1,TANG Xin-hua2,GAI Lian-lei3,KONG Xiao-ping4,HAO Bo1,HUANG Er-wen1,SHI He5, SHENG Li-hui6,QUAN Li1,LIU Shui-ping1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;2.Dongyuan Public Security Bureau,Dongyuan 517500,China;3.Huangpu Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510530,China;4.Panyu Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 511430,China;5.Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510030,China;6.Institute of Criminal Science and Technology,Shenzhen Municipal Public Security Bureau,Shenzhen 518008,China）

ObjectiveTo explore the genetic variation sites of caveolin（CAV）and their correlation w ith sudden unexp lained death（SUD）.MethodsThe blood samples were collected from SUD group（71 cases）, coronary artery disease（CAD）group（62 cases）and control group（60 cases）,respectively.The genome DNA were extracted and sequencing was performed directly by amplifying gene coding region and exonintron splicing region of CAV1 and CAV3 using PCR.The type of heritable variation of CVA was confirmed and statistical analysis was performed.ResultsA total of 4 variation sites that maybe significative were identified in SUD group,and two were new found which were CAV1：c.45C＞T（T15T）and CAV1：c.512G＞A（R171H）,and two were SNP loci which were CAV1：c.246C＞T（rs35242077）and CAV3：c.99C＞T（rs1008642）and had significant difference（P＜0.05）in allele and genotype frequencies between SUD and control groups.Forementioned variation sites were not found in CAD group.ConclusionThe variants of CAV1 and CAV3 may be correlated w ith a part of SUD group.

forensic pathology;forensic genetics;death,sudden,cardiac;sudden unexplained death;caveolin;gene mutation;single nucleotide polymorphism

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.002

1004-5619（2017）02-0114-06

2016-12-05）

（本文編輯：黃平）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81430046，81671866）；十二五國家重大科技攻關(guān)項目（2012BAK02B002）；廣東省自然科學(xué)基金自由申請項目（2016A030313223）；上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題資助項目（2013KF1307）

午方宇（1992—），男，碩士研究生，主要從事心源性猝死的病理學(xué)研究；E-mail：719139789@qq.com

羅斌，男，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事心源性猝死、過敏性休克的病理學(xué)研究；E-mail：luobin@mail. sysu.edu.cn