京尼平苷酸對大鼠缺血性腦損傷神經保護作用*

黃嘉駒，嚴 莉，歐陽昌漢**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.武漢市中心醫(yī)院藥學部)

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京尼平苷酸對大鼠缺血性腦損傷神經保護作用*

黃嘉駒1,2，嚴 莉1，歐陽昌漢1**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.武漢市中心醫(yī)院藥學部)

目的 觀察口服京尼平苷酸對缺血性腦損傷大鼠的保護作用。方法 SD大鼠隨機分成四組，假手術組、腦缺血模型組、京尼平苷酸組和安理申對照組，每組10只。采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學習記憶能力；HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)、皮質內錐體層、扣帶回皮質層和皮質外顆粒層的神經元數量的變化。結果 水迷宮結果顯示假手術組和腦缺血模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為(31.81±9.51)s、(87.21±12.18)s；京尼平苷酸組大鼠平均逃避潛伏期為(45.48±15.04)s比腦缺血模型組明顯縮短(P<0.01)。HE染色結果腦缺血模型組相對于假手術組各腦區(qū)神經元總數顯著降低，變性神經元數和變性率顯著增加(P<0.01)。京尼平苷酸組與腦缺血模型組相比較，CA1區(qū)、扣帶回區(qū)、外顆粒層及內錐體層4個腦區(qū)的神經元總數均顯著增加，變性神經元數及變性率均顯著降低(P<0.01)。京尼平苷酸組與安理申對照組比較，除在CA1區(qū)神經元總數方面前者高于后者(P<0.01)以外，其余各腦區(qū)指標的差異均無差異(P>0.05)。結論 京尼平苷酸可以改善大鼠缺血性腦損傷，能減少缺血性腦損傷大鼠大腦皮質和海馬神經元的缺血性壞死。

京尼平苷酸；慢性腦缺血；大腦皮質；神經保護

缺血性腦損傷極大地危害人們的身心健康。近年來，對急性腦缺血損傷機制和預防治療的研究不斷增多，而對慢性腦缺血的研究相對較少。由于原發(fā)疾病導致的慢性腦缺血，早期并不表現(xiàn)出明顯的腦損傷癥狀，沒有引起人們對慢性腦缺血足夠的重視，也沒有采取相應的預防措施和很好的治療手段。隨著經濟社會的發(fā)展和醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，人口老齡化現(xiàn)象越來越嚴重，慢性腦缺血問題逐漸引起大家的廣泛關注。近年研究發(fā)現(xiàn)，常用中藥梔子主要有效成分環(huán)烯醚萜苷類具有多重藥理功能，具備良好的臨床應用前景，受到廣泛關注[1]。京尼平苷酸也稱梔子苷酸，是梔子果實的主要藥效成份之一。本文通過建立慢性腦缺血實驗動物模型，考察京尼平苷酸對腦缺血性損傷的神經保護作用，為臨床藥物開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 取60只健康SPF級、雄性、體重(240±20)g的SD(Sprague-Dawley)大鼠[由武漢大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK(鄂)，2008-0004]。實驗動物自由飲水、進食，正常晝夜節(jié)律，室溫控制在25℃。在實驗前通過Morris水迷宮實驗，對動物進行篩選。挑選逃避潛伏期大約在120s范圍內大鼠為實驗對象，棄用有視力障礙、靈活性太差或逃避潛伏期過低(<40s)的大鼠。隨機數字表法將實驗動物共分成四組：假手術組、慢性腦缺血模型組、京尼平苷酸組、安理申對照組。除假手術組外，其它各組大鼠均采用雙側頸總動脈(CCA)永久性結扎法(2-VO法)造模。假手術組大鼠只分離雙側頸總動脈，但不結扎剪斷動脈。剔除因手術意外死亡的大鼠后，每實驗組各10只大鼠。

1.2 實驗材料 京尼平苷酸(含量96.2%，批號：syz090911，四川雙子葉生物科技有限公司)；肝素鈉(Solarbio 試劑公司)；鹽酸多奈哌齊[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號：091028A]；顯微照相儀(OLYMOUS，BX-41)；Morris水迷宮(湖北科技學院醫(yī)藥研究院平臺提供)；Morris圖象采集分析器(中國醫(yī)科院藥物研究所)；Motic Image Advanced 3.2圖像軟件(德國麥克奧迪公司)。

1.3 慢性腦缺血模型制作 根據文獻[2-3]采用雙側頸總動脈(CCA)永久性結扎制作慢性腦缺血損傷模型(2-VO模型)。大鼠術前禁食12h、禁水4h。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350mg/kg)。待麻醉充分后，取仰臥位固定，頸前部稍微剪除毛發(fā)、常規(guī)消毒后，沿頸前部正中切開、分離肌肉，鈍性分離出雙側CCA(注意避免損傷與之伴行的迷走神經)，在近頸總動脈末端處套上兩根0號絲線，間隔5mm左右，分別結扎雙側CCA后，從中間剪斷CCA，要確保已阻斷動脈血流，然后逐層縫合切口，消毒，待醒。假手術組除了不結扎剪斷CCA外，其它步驟同上。術后肌注青霉素0.2萬U/d，連續(xù)3d。

1.4 給藥方式 假手術組和腦缺血模型組灌胃等體積生理鹽水；京尼平苷酸組給藥劑量50mg/(kg·d)；安理申(鹽酸多奈派齊)對照組給藥劑量1.75 mg/(kg·d)。手術過程中若出現(xiàn)死亡則補足數量。大鼠用藥劑量和人用藥劑量換算按體表面積計算，每組1次/d，連續(xù)給藥28d。

1.5 Morris水迷宮學習記憶行為測試

1.5.1 Morris水迷宮構造[4]Morris水迷宮由圓形水池和全自動攝像記錄系統(tǒng)兩部分組成。不銹鋼水池直徑150cm、池深60cm，實驗時水深約40cm，池壁和池底用涂料涂成全黑色。水池分為四個象限，在其中一象限中放一平臺，平臺涂成黑色，平臺低于水面約1.5cm，動物可爬上平臺站立休息。每次實驗時將大鼠面向池壁放入水池中，依次從4個象限中挑選一個作為入水點，通過攝錄機記錄大鼠游泳軌跡，歷時6d，分別進行定位航行實驗和空間探索實驗，并通過Morris圖象處理軟件對數據進行采集、分析。

1.5.2 行為學測試過程[5]

(1)定位航行實驗(Place navigation) 實驗前，水池中先不安放平臺，逐一將各組大鼠放入水池中，自由游泳2～4min，先熟悉水池及周邊環(huán)境。實驗第1～4d為訓練時間，具體訓練方法為：每天測試4次，上午下午各2次，每次2min。需要注意每次實驗時必須在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限邊緣的固定位置，分別將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠從入水到找到平臺并爬上平臺所用時間，也就是逃避潛伏期(platform locating latency，PLL)。最大逃避潛伏期為120s，如果大鼠在120s時間內還不能找到平臺，可由實驗助手助其登上平臺，并讓其在平臺站立30s。實驗第5d，首先選取靠平臺最遠象限為入水點，然后依次按序進行下一入水點進行測試。記錄上下午共16個入水點的逃避潛伏期時間，并取平均值作為測試的平均逃避潛伏期值。

(2)空間探索實驗(Spatial probe test) 在定位航行實驗之后，撤除平臺，選擇離平臺最遠象限為入水點，攝錄大鼠在水池中120 s內的游泳軌跡。由水迷宮配套的攝像軟件記錄120s內游泳總距離、各象限內的游泳距離及穿越平臺次數，統(tǒng)計各組大鼠在平臺象限內游泳時間/總時間(%)，以此作為評價大鼠記憶能力的指標，并將各組大鼠的游泳軌跡作為評價記憶能力的參考。

1.6 腦組織形態(tài)學實驗 大鼠Morris水迷宮所有實驗結束后，腹腔注射10%水合氯醛(0.35mL/0.1kg)麻醉，左心室依次灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛。灌注結束，迅速開顱小心取出腦組織，分離顱骨時要小心，注意保護硬腦膜不受損傷。4℃下固定過夜后，取胼胝體與穹窿交界處向下與視交叉后緣連線，自此向后切2mm，脫水，包埋，裝片，行HE染色。在成像系統(tǒng)輔助下，每張切片隨機選取10個視野，在400倍視野下記錄該視野下神經元總個數和變性神經元個數，并觀察神經元細胞形態(tài)，計數統(tǒng)計。

2 結 果

2.1 定位航行實驗結果 定位航行測試結果顯示，與假手術組相比較，腦缺血模型組大鼠學習成績(平均逃避潛伏期)較差(P<0.01)，提示雙側頸總動脈結扎缺血4周可導致大鼠學習能力的下降，說明永久性結扎大鼠雙側頸總動脈法制備慢性低灌注腦缺血損傷實驗動物模型的方法建立成功。安理申對照組、京尼平苷酸組大鼠的學習能力均優(yōu)于模型組，其中安理申對照組與腦缺血模型組相比較，具有顯著性差異(P<0.05)，而京尼平苷酸組與腦缺血模型組的差異更為顯著(P<0.01)，見表1。上述結果表明京尼平苷酸可以顯著改善慢性低灌注腦缺血損傷大鼠的學習能力，提示京尼平苷酸對大鼠缺血性腦損傷具有神經保護作用。

表1 各組大鼠定位航行實驗結果

與腦缺血模型組比較，*P<0.05、**P<0.01

2.2 空間探索實驗結果

2.2.1 空間探索實驗結果 與假手術組比較，腦缺血模型組大鼠的記憶成績(平臺象限時間/總時間)較差(P<0.01)，與腦缺血模型組相比，給藥的兩組大鼠的記憶成績均優(yōu)于腦缺血模型組(P<0.01)，其中京尼平苷酸組記憶成績更好，見表2。以上結果表明京尼平苷酸可以明顯改善慢性低灌注腦缺血大鼠的記憶能力，也提示京尼平苷酸對大鼠缺血性腦損傷具有神經保護作用。

表2 各組大鼠空間探索實驗結果

與腦缺血模型組比較，**P<0.01

2.2.2 空間探索實驗大鼠游泳軌跡 撤除平臺后各組大鼠游泳路徑如圖1(封二)所示，對比分析各組四個象限內大鼠游泳軌跡，假手術組游泳軌跡多在原平臺所在象限內；腦缺血模型組游泳軌跡沿池壁運動較多，在所設定的四個象限滯留時間相似；京尼平苷酸組大鼠運動軌跡主要集中在原平臺所在象限內，顯現(xiàn)良好的記憶改善趨勢；安理申對照組雖然在原平臺象限的時間沒有較明顯的改善，但是沿池壁運動較少，顯示出較明顯的探索特性。

2.3 HE染色結果

2.3.1 各組大鼠海馬和皮質區(qū)組織病理形態(tài)學變化 鏡下觀察可見，假手術組大鼠各腦區(qū)神經元形態(tài)正常、排列齊整規(guī)則，細胞核邊緣清楚，染色均勻，核仁清晰，細胞周圍間隙小或無間隙，海馬錐體細胞排列較密、層次清楚，核固縮深染、空泡變性等變性細胞很少。而腦缺血模型組大鼠大腦皮質和海馬神經元變性嚴重，變性神經元胞核邊界不清、核仁腫脹或消失、核固縮濃染、空泡變性多、樹突呈螺旋狀變形、細胞間隙增大；海馬錐體細胞水腫密度降低，呈無序排列，有少量核固縮深染細胞，細胞間隙變大。京尼平苷酸組、安理申對照組大鼠各腦區(qū)的神經元變性情況均好于腦缺血模型組，見圖2(封二)。

2.3.2 各組大鼠海馬和皮質區(qū)神經元統(tǒng)計結果(見表3～6)。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元變性情況統(tǒng)計

與假手術組比較，**P<0.01；與腦缺血模型組比較，##P<0.01

表4 各組大鼠皮質扣帶回區(qū)神經元變性情況統(tǒng)計

與假手術組比較，**P<0.01；與腦缺血模型組比較，##P<0.01

表5 各組大鼠皮質內錐體層神經元變性情況統(tǒng)計

與假手術組比較，**P<0.01；與腦缺血模型組比較，##P<0.01

表6 各組大鼠皮質外顆粒層神經元變性情況統(tǒng)計

與假手術組比較，*P<0.05、**P<0.01；與腦缺血模型組比較，##P<0.01

3 討 論

本實驗用2-VO方法制作慢性腦缺血模型，阻斷大鼠雙側頸總動脈血流，整個腦組織僅靠椎基底動脈供血造成腦部持續(xù)性低灌注腦缺血狀態(tài)。一般認為2-VO在3周后即進入慢性腦缺血期[6]。本次Morris迷宮實驗結果中，平臺跨越次數反應了實驗動物的學習能力情況，空間探索實驗反應了實驗動物學習能力情況，由結果可知，口服京尼平苷酸能夠改善由慢性低灌注引起的學習記憶能力損傷。安理申是可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于治療中毒阿爾茲海默病。從Morris水迷宮結果可以看到，安理申對照組平臺跨越次數，比腦缺血模型組少，顯示其未能改善實驗大鼠的學習能力。

海馬是一個卷繞折疊的皮質結構，由幾個相關皮質區(qū)構成[7]，依據細胞形態(tài)，不同皮質區(qū)發(fā)育差異以及各種纖維通路的不同，分成CA1、CA2、CA3、CA4四個扇形區(qū)。Naudi等[8]發(fā)現(xiàn)各腦區(qū)的神經元易損性按遞減的排列順序是CA1>CA3。其中CA1區(qū)與人類學習記憶關系最為密切，具有對缺血的選擇易損傷性[9]。大腦皮質可分為舊皮質和新皮質，舊皮質占據整個大腦皮質的10%，新皮質占大腦皮質的90%，本文所指大腦皮質主要是指新皮質，一般由外向內均可分為六層結構即分子層、外顆粒層、外錐體細胞層、內顆粒層、內錐體細胞層、多形層。有研究表明[10]，對缺血敏感性高低依次為：神經細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、內皮細胞。本文前期實驗結果顯示大腦皮質各層中對缺血性損傷敏感的部位除了皮質外顆粒層和皮質內錐體層以外，可能還有一個很重要的部位就是扣帶回皮質層。所以選擇了皮質外顆粒層、皮質內錐體層以及扣帶回皮質層三個部位研究探索京尼平苷酸對大鼠腦缺血損傷的保護作用機制。

結果顯示，京尼平苷酸可顯著降低模型大鼠海馬CA1區(qū)、皮質扣帶回、皮質外顆粒層、皮質內椎體層的神經元丟失情況，改善神經元變性。以上結果表明，京尼平苷酸對慢性腦缺血引起的神經損傷具有較好的神經保護作用。但是對于京尼平苷酸保護神經元的具體作用機制，有待深入研究。

[1]張君，程笑，楊歡，等.山奈酚對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及機制探討[J].中國藥理學通報,2017,33(1)：39

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Study of Neuroprotection of Geniposidic Acid on Ischemic Brain Injury of Rat

HUANG Jia-ju,YAN Li,OUYANG Chang-han

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To study the protective effect of oral administration of geniposidic acid on ischemic brain injury in rats. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into one of four groups in equal numbers (n = 10): sham operation group,cerebral ischemia model group,geniposidic acid group and Anli Shen group.Morris water maze test was used to evaluate the learning and memory ability of rats.HE staining was used to observe the changes of neuronal cells in hippocampal CA1 region,cortical pyramidal layer,cingulate cortex and extracorporeal granule layer.Results Morris water maze showed that the mean escape latency was (31.81±9.51)s in sham operation group and(87.21±12.18)s in model group.The mean escape latency of the geniposidic acid group was (45.48±15.04)s and significantly shorter than that of the model group(P<0.01).The total number of neurons in the brain of the HE staining model was significantly decreased,and the number of degenerated neurons and degeneration rate was increased significantly(P<0.01).Compared with the model group,the geniposidic acid group number of neurons in the CA1 region,the cingulate zone,the outer granular layer and the inner cone layer significantly increased,and the number of deformed neurons and degeneration rate were decreased significantly(P<0.01).There was no significant difference between the other groups(P> 0.05).Conclusion Geniposidic acid can improve ischemic brain injury in rats and reduce ischemic necrosis of cerebral cortex and hippocampal neurons in rats with ischemic brain injury.

Geniposidic acid;Chronic cerebral ischemia;Cerebral cortex;Neuroprotection

湖北省衛(wèi)計委面上項目(WJ2017M248)；國家級創(chuàng)新訓練項目(201410927002)

R-332

A

2095-4646(2017)02-0093-05

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.02.0095

2016-12-03)

**通訊作者，E-mail：176788542@qq.com