仔豬大腸桿菌性腹瀉的快速診斷

袁東升

(淮安市動物疫病預防控制中心,江蘇淮安 223001)

仔豬大腸桿菌性腹瀉的快速診斷

袁東升

(淮安市動物疫病預防控制中心,江蘇淮安 223001)

仔豬大腸桿菌性腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種常見傳染病，可導致仔豬體生長停滯，嚴重者導致死亡。本試驗采集了一例似仔豬大腸桿菌性腹瀉的直腸病料，利用PCR方法對病料的增菌培養(yǎng)物進行了檢測，確定了此例仔豬腹瀉與HPI＋大腸桿菌感染有關，同時也檢測到產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）。

仔豬 腹瀉 大腸桿菌 快速診斷

大腸桿菌是大腸埃希氏菌的俗稱，乃人和溫血動物腸道內(nèi)正常菌群成員之一，人和動物出生后數(shù)小時即可經(jīng)口進入消化道后段，大量繁殖而定居，終生伴隨。大腸桿菌引起仔豬腹瀉癥狀的疾病包括黃痢、白痢、斷奶仔豬腹瀉及仔豬水腫病。

1 仔豬黃痢

黃痢是新生仔豬的一種急性致死性傳染病，又名初生仔豬大腸桿菌病，以腹瀉、排黃色液體糞便為主要特征，發(fā)病時間在出生后幾小時至5日之間，1～3日齡更為多見，多為同窩發(fā)生。非免疫豬群初次感染的發(fā)病率可達100%。第1胎母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率與死亡率較高，但在有感染史或經(jīng)免疫的豬群，發(fā)病率則低得多。

臨床癥狀為最初突然發(fā)生腹瀉，拉黃色水樣糞便，內(nèi)含凝乳小塊，肛門陰戶紅腫，迅速脫水和電解質(zhì)失衡。發(fā)病豬可在幾小時內(nèi)死亡，有的仔豬沒有出現(xiàn)腹瀉就已經(jīng)死亡。在流行較為嚴重的豬場，少量病豬可能出現(xiàn)嘔吐，加之體液向腸道的大量流入，可使體重下降30%～40%，病伴有脫水、腹肌松弛、無力、精神沉郁等癥狀，不久就死亡。

2 仔豬白痢

仔豬白痢多見于10～30日齡仔豬，尤以2～3周齡豬常發(fā)。仔豬突然發(fā)生腹瀉，排出乳白色或灰白色漿狀或糊狀的糞便，糞便具有腥臭味，病程2～3d；若不治療，一般經(jīng)過5～6d死亡或轉(zhuǎn)為慢性，以后仔豬生長發(fā)育不良，病豬若有良好的管理及適當?shù)闹委?，一般預后良好，但仔豬生長緩慢，飼料報酬低。病死的仔豬外表蒼白，消瘦，肛門和尾部附有污穢的帶灰白色、腥臭的糞便，腸黏膜有卡他性炎癥，結(jié)腸內(nèi)容物呈乳白色或灰白色，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹，胃內(nèi)乳汁凝結(jié)不全，并有大量的氣體，腸黏膜充血，出血。

該病的病原也是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，其黏附素和毒素等毒力因子特性以及血清型與仔豬黃痢的病原相似。在適宜的環(huán)境中，感染仔豬或隱性感染仔豬的ETEC可存活數(shù)周，被仔豬攝入而感染，不良環(huán)境衛(wèi)生（如環(huán)境溫度太低、穿舍風、消毒不徹底）可促使該病的發(fā)生，而實行全進全出制和干凈、溫暖、干燥的環(huán)境則可以減少本病的發(fā)生。

3 仔豬腹瀉

斷奶仔豬腹瀉多發(fā)于4～12周齡仔豬，是由產(chǎn)vero細胞毒素大腸桿菌引起的傳染性腸毒血癥，仔豬斷奶后，由于斷奶應激，體內(nèi)母源抗體的逐漸消失，消化道內(nèi)環(huán)境的改變，以及飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)條件、環(huán)境因素的忽然改變，導致機體的抵抗力下降，當易感仔豬感染病原性細菌后，細菌通過其自身的菌毛附著于小腸絨毛上，從而在小腸內(nèi)定居，并開始大量生長和繁殖，在這過程中產(chǎn)生毒素并被吸收，從而引起一系列臨床癥狀并導致仔豬死亡。

4 斷奶仔豬水腫病

ED是仔豬的一種腸毒血癥，由產(chǎn)Vero細胞毒素大腸桿菌引起，常發(fā)生于斷奶后5～14d或剛轉(zhuǎn)入育肥群的斷奶仔豬，以眼結(jié)膜、咽部、胃大彎、腸系膜等部位水腫為主要特征。感染豬群的發(fā)病率變化很大，在某些豬群可高達80%，但平均為30%～40%，死亡率為50%～90%。多表現(xiàn)為突然發(fā)病、精神沉郁、食欲減少、口流白沫、病豬靜臥、肌肉震顫、抽搐、共濟失調(diào)，某些病豬可能出現(xiàn)輕度腹瀉，但便秘更常見。

引起仔豬腹瀉的大腸桿菌通常是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。但新近發(fā)現(xiàn)的一些攜帶毒力島的大腸桿菌在動物中也具有重要的致病作用。本次試驗對采自淮安市獸醫(yī)站動物門診部一例疑似仔豬大腸桿菌性腹瀉病料，通過PCR的方法進行了致病性大腸桿菌的檢測。

5 典型病例

2015年12月取來某養(yǎng)豬戶一例疑似仔豬黃白痢的仔豬。就診時仔豬有腹瀉、嘔吐和氣喘癥狀；經(jīng)臨床剖解發(fā)現(xiàn)肺瘀血，水腫并有25%面積的壞死；全身淋巴結(jié)、肝都腫大并瘀血；腎有白色壞死點、蒼黃；腸道黏膜卡他性炎癥；脾臟瘀血，膽汁稀薄。經(jīng)實驗室診斷豬細小、豬瘟和偽狂犬病病毒全為陰性。

6 診斷

6.1 實驗室檢查

6.1.1 培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂（Mackonkey agar，蛋白胨20g，乳糖10g，氯化鈉5g，牛膽鹽5g，中性紅0.025g，瓊脂粉20g，加蒸餾水1000mL，pH7.3+0.2）購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨2克，酵母抽提物1克，氯化鈉2g，加蒸餾水200mL，pH7.2）。

6.1.2 試劑

PCR試劑盒（包括Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer（Mg2+Free）、MgCl2）、10×loading buffer、DL-2000 Marker均購自大連寶生物工程有限公司。

6.1.3 引物

用于HPI毒力島保守基因和腸毒素ST1、ST2、LT1基因的擴增引物，揚州大學獸醫(yī)學院成大榮老師設計，由大連寶生物工程公司合成。

用于irp2基因與LT1、ST1、ST2基因擴增PCR引物

6.2 實驗儀器

（1）電子天平：HAnGPINGJA2003；

（2）攪拌器：H-1微型混合器，上海彭氏實業(yè)有限公司；

（3）壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；

（4）無菌超凈臺：蘇州凈化設備有限公司；

（5）離心機：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠；

（6）HQ45B恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；

（7）PCR擴增儀：型號2400，美國PE公司；

（8）電泳儀：DYY-2，北京市六一儀器廠；

（9）電熱恒溫培養(yǎng)箱：HG303-4K，南京實驗儀器廠；

（10）振蕩器：WH-1微型旋渦混合儀，上海滬四分析儀器廠。

6.3 實驗方法

6.3.1 病料采集

用滅菌剪刀剪取了仔豬的3段小腸腸段，兩頭分別用棉繩結(jié)扎，放入塑料袋中，存入-20℃冰箱備用。

6.3.2 細菌的增菌培養(yǎng)

在超凈臺上，用酒精燈滅菌冷卻后的波爾環(huán)輕輕插入腹瀉仔豬直腸，蘸取直腸內(nèi)容物并在麥康凱培養(yǎng)基上進行3區(qū)劃線，37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。挑粉紅色單個菌落再在麥康凱培養(yǎng)基上進行分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24h。連續(xù)純培養(yǎng)3代，得到8株細菌的純培養(yǎng)物。

6.3.3 細菌DNA模板的制備

在超凈臺上，取1.5mL滅菌指形管并在其中加入50ul水，然后挑取步驟2.2中培養(yǎng)基上細菌的純培養(yǎng)物放入其中，置100℃煮沸10min，然后迅速在-20℃下冷卻5min，最后從冰箱內(nèi)取出放進離心機內(nèi)，12000r/min離心5min，取上清，即為DNA模板。置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.3.4 HPI＋大腸桿菌的快速PCR檢測

將irp-F，irp-R引物混合，濃度均為25μmol/L.按以下體系反應：

（以上試劑均加入0.5mL指形管中，混合均勻）

PCR循環(huán)參數(shù)的選擇：

6.3.5 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的快速PCR檢測

將LT1、ST1、ST2引物混合，濃度均為25μmol/L.按以下體系反應：

（以上試劑均加入0.5mL指形管中，混合均勻）

PCR循環(huán)參數(shù)的選擇：

6.3.6 PCR產(chǎn)物電泳鑒定

配制1%瓊脂糖溶液，按0.5mg/L加溴化乙錠（EB）制膠，取10μL PCR產(chǎn)物點樣（加2μL 10×Loading Buffer），35V電泳0.7h，取出凝膠，紫外燈下鑒定，明膠成像系統(tǒng)拍照。

7 結(jié)果

7.1 HPI＋大腸桿菌的快速PCR檢測結(jié)果

用引物irp2-F和irp2-R對HPI+大腸桿菌進行DNA擴增，可擴增到一段約280bp的片段。對8株大腸桿菌用PCR方法進行DNA的擴增，其中4株擴增出irp2的特異性片段（圖1）。由此判斷可得出，此例仔豬大腸桿菌性腹瀉病料中含有HPI+大腸桿菌。

圖1 irp2 PCR產(chǎn)物電泳圖

7.2 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的快速PCR檢測結(jié)果

用引物LT1-1 LT1-2、ST1-1 ST1-2、ST2-1、ST2-2對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進行DNA擴增，可預期分別擴增到大小約282bp、183bp、360bp的片段【3】。對8株大腸桿菌使用多重PCR方法進行DNA的擴增，只檢測到3株有ST1特異性片段（圖2），其余腸毒素特異性條帶并未檢測到。由此實驗數(shù)據(jù)得出，此例仔豬大腸桿菌性腹瀉病料中含有ETEC。

圖2 ST1 多重PCR產(chǎn)物電泳圖

以上數(shù)據(jù)表明此例疑似仔豬大腸桿菌性腹瀉與HPI+大腸桿菌和ETEC均有關。

8 討論

預防仔豬大腸桿菌病的關鍵在于降低致病性大腸桿菌感染的機會和保證仔豬從初乳獲得足夠的被動免疫保護，可通過將產(chǎn)仔舍分開、實行全進全出制和保持清潔、溫暖、干燥環(huán)境減少本病的發(fā)生。仔豬對致病性大腸桿菌的易感性依賴于腸內(nèi)特異抗體的存在，盡管仔豬在出生后第1周即開始產(chǎn)生主動抗體，但在出生后2—3周主要依賴母源抗體的保護。初乳中含有豐富的IgG抗體，常乳則以IgA占優(yōu)勢。

近幾十年來，國內(nèi)外對仔豬水腫病的免疫預防進行了較為廣泛的研究，目前國內(nèi)也已從最初的藥物預防轉(zhuǎn)向疫苗預防。由于毒素在水腫病致病機理中的重要作用，因此對Stx2e免疫原性進行了不少研究。隨著Stx2e的進一步純化和分子生物學技術的發(fā)展，人們又用Stx2e的類毒素作為免疫原和Stx2e。突變體進行豬的免疫試驗。目前我國仔豬水腫病的預防主要采用致病菌株制成的滅活疫苗。然而，傳統(tǒng)的仔豬水腫病疫苗只是以菌株的O抗原為基礎，并沒有考慮水腫毒素Stx2e和菌毛F18ab，故其免疫效果不好。鑒于Stx2e水腫毒素和F18ab菌毛是水腫病的重要致病因子，我們在新一代仔豬水腫病疫苗的研制中，除了考慮0139、0138、0141菌體抗原之外，還利用含水腫毒素Stx2e抗原和菌毛F18ab抗原的菌株用于制苗，是仔豬水腫病疫苗研制的一大改進。

由此看來，仔豬大腸桿菌性腹瀉的快速診斷就顯得極其有用，通過PCR測定其特定基因（HPI中的irp2 ETEC中的ST、LT）便能得知感染的是何種大腸桿菌，對癥治療。

[1] 盧珊，任志鴻，陳凱，等.攜帶HPI毒力島的大腸桿菌的毒力基因分析[J].中國人獸共患病學報，2007，23（7）：639-642.

[2] 成大榮，朱善元.大腸桿菌與仔豬疾病[J].豬業(yè)科學，2008，25（8）：127.

本論文為省農(nóng)業(yè)三新工程 SXGC〔2016〕147項目