安徽烏菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生體系建立

秦艷梅，王明霞，江海坤，嚴(yán)從生，王艷，田紅梅，張其安，方凌

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，合肥，230031）

●育種研究●

安徽烏菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生體系建立

秦艷梅，王明霞，江海坤，嚴(yán)從生，王艷，田紅梅，張其安，方凌

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，合肥，230031）

以6份安徽烏菜為試材，研究基因型、6-BA、AG對(duì)烏菜小孢子胚狀體發(fā)生的影響及6-BA對(duì)植株再生的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同基因型烏菜的小孢子胚誘導(dǎo)率具有明顯差異，6份烏菜材料中有3份誘導(dǎo)出胚狀體，H-4出胚率最高，平均每花蕾誘導(dǎo)8.76個(gè)胚；NLN-13培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L 6-BA和AG 10 mg/L均能促進(jìn)胚狀體發(fā)生，后者促進(jìn)作用更明顯；MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L 6-BA可提高烏菜胚狀體成苗率。

烏菜；小孢子培養(yǎng)；誘導(dǎo)率；胚狀體；植株再生

安徽烏菜是安徽省名優(yōu)特產(chǎn)，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個(gè)變種，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，常規(guī)雜交法育種年限較長(zhǎng)，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行烏菜育種對(duì)提高育種水平和效率至關(guān)重要。

游離小孢子培養(yǎng)是育種中最有效的生物技術(shù)之一，在大白菜、不結(jié)球白菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有報(bào)道[1～4]，而對(duì)于烏菜的小孢子培養(yǎng)研究較少，存在胚狀體誘導(dǎo)率低的問(wèn)題。本試驗(yàn)選用6份不同基因型的安徽烏菜為試材，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，探討6-BA（6-芐氨基嘌呤）和AG（阿拉伯半乳聚糖）對(duì)烏菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響及6-BA對(duì)胚狀體植株再生的影響，為建立優(yōu)化烏菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用安徽地方烏菜材料6份，材料編號(hào)1403、1404、1408、1416、1418、H-4。

試驗(yàn)材料于2015年9月6日播種，10月4日定植，露地栽培，常規(guī)管理。2015年12月，每份材料選取10株移植到塑料大棚。2016年3～4月初花期至盛花期選取適宜大小的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

①胚誘導(dǎo)培養(yǎng) 小孢子培養(yǎng)基本操作流程參照申書興等[5]大白菜游離小孢子培養(yǎng)方法。在初花期至盛花期，于晴天8：00～10：00，選取健壯、大小適宜的花蕾（花瓣與花藥長(zhǎng)度比例1∶2～3∶4，多數(shù)小孢子處于單核靠邊期），以主枝和一級(jí)側(cè)枝上的花蕾為宜。放入25 mL無(wú)菌小燒杯中，首先用70%酒精消毒30 s，其次用2.5%NaClO溶液消毒5 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次；加入B5無(wú)菌液體培養(yǎng)基，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來(lái)，經(jīng)350目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液于15 mL旋蓋離心管中，于1 000 r/min離心3 min，棄上清，重復(fù)2次，得游離純化的小孢子。

將分離純化后的小孢子分別附加 0、0.2、0.4 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）或0、5、10、20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）的NLN-13培養(yǎng)基制成懸浮液，添加活性炭0.1 mg/mL，調(diào)整小孢子密度約1× 105個(gè)/L，分裝于直徑60 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以Parafilm膜封口，每份材料取花蕾25個(gè)，分裝于4皿培養(yǎng)，重復(fù) 3次。33℃黑暗熱激培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入25℃黑暗條件下培養(yǎng)，有肉眼可見(jiàn)的胚出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)速60 r/min的搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)至形成子葉型胚狀體，3周后統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)目。

②胚狀體植株再生 利用附加濃度為0、1 mg/L 6-BA，10 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖的MS固體無(wú)菌培養(yǎng)基作為胚狀體成苗培養(yǎng)基，將獲得的烏菜成熟胚狀體轉(zhuǎn)接入成苗培養(yǎng)基中，3周后統(tǒng)計(jì)成苗率。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體基因型的影響

在6份烏菜材料游離小孢子培養(yǎng)中，有3份誘導(dǎo)出胚狀體（H-4、1404、1408），占參試材料的50%。其中H-4產(chǎn)胚能力較強(qiáng)，在添加10 mg/L AG的NLN-13培養(yǎng)基中，平均每花蕾可誘導(dǎo)8.76個(gè)胚；1408次之，平均每花蕾可誘導(dǎo)2.91個(gè)胚；1404平均每花蕾可誘導(dǎo)1.16個(gè)胚。而1403、1416、1418則沒(méi)有胚狀體產(chǎn)生?？梢?jiàn)，不同基因型烏菜材料的小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率存在差異。

2.2 6-BA對(duì)烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

在NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA，胚狀體誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)于能誘導(dǎo)出胚的3份材料，6-BA濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響均呈單峰變化，低濃度的6-BA對(duì)烏菜小孢子胚誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)6-BA濃度為0.2 mg/L時(shí)，胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，烏菜1404、1408、H-4平均每花蕾誘導(dǎo)胚狀體數(shù)目依次為3.64、1.16、0.68個(gè)。

2.3 AG對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

在NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度AG，25℃暗培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖2），低濃度的AG對(duì)烏菜小孢子胚誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，高濃度的AG則有抑制作用。當(dāng)AG濃度為10 mg/L時(shí)，胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，3份供試烏菜的胚狀體誘導(dǎo)率隨濃度變化趨勢(shì)表現(xiàn)一致。

2.4 6-BA對(duì)胚狀體成苗的影響

選擇成熟的烏菜胚狀體轉(zhuǎn)接入成苗培養(yǎng)基（圖3），表1中結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基中加入1 mg/L 6-BA可提高烏菜試材1408和H-4的胚狀體成苗率，且促進(jìn)作用顯著，但1404的胚狀體并未形成雙單倍體植株，說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加6-BA并不是對(duì)所有基因型的烏菜胚狀體成苗具有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

小孢子胚胎發(fā)生能力受基因調(diào)控。在白菜小孢子培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，不同基因型間小孢子胚狀體誘導(dǎo)率差異很大[1，6，7]。本試驗(yàn)中6份供試烏菜有 3份可誘導(dǎo)出胚狀體，成功率為50%，不同基因型烏菜出胚率差異較大，與前人在其他作物上相關(guān)研究結(jié)果一致。

圖1 NLN-13培養(yǎng)基中添加6-BA對(duì)烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的影響

圖2 NLN-13培養(yǎng)基中添加AG對(duì)烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的影響

圖3 烏菜小孢子培養(yǎng)胚狀體及植株再生

適量的6-BA可顯著提高白菜小孢子胚狀體或愈傷組織誘導(dǎo)率[2～4]；蔣武生等[8]則認(rèn)為加入 6-BA和NAA抑制大白菜小孢子胚發(fā)生。AG對(duì)小麥、大白菜和普通白菜小孢子培養(yǎng)胚發(fā)生和直接成苗有促進(jìn)作用[9，10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在NLN-13培養(yǎng)基中分別添加6-BA和AG可大大提高烏菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)率，促進(jìn)小孢子細(xì)胞發(fā)育由配子體途徑向孢子體途徑轉(zhuǎn)變。在一定程度上解決烏菜胚狀體誘導(dǎo)率低的問(wèn)題，但是本試驗(yàn)中6份供試材料僅3份誘導(dǎo)出胚，并不能解決所有烏菜難誘導(dǎo)出胚的問(wèn)題，所以針對(duì)其他烏菜材料胚誘導(dǎo)條件以及胚胎發(fā)生機(jī)理還需要進(jìn)一步試驗(yàn)摸索，以優(yōu)化烏菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。

表1 6-BA對(duì)烏菜小孢子胚狀體成苗的影響

本試驗(yàn)烏菜小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，在MS培養(yǎng)基中附加1 mg/L 6-BA有促進(jìn)烏菜1408和H-4的胚狀體再生植株的作用，而1404胚狀體則未形成植株，可能由試材1404的胚狀體本身生活力弱和其對(duì)6-BA的應(yīng)答反應(yīng)不同2種原因共同導(dǎo)致。通過(guò)改變6-BA的濃度或加入一定濃度AG是否能進(jìn)一步提高胚狀體成苗率尚待研究。

[1]陳曉峰，張明培，徐榕雪，等.影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生因素的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，39（5）：76-79.

[2]付文婷，張魯剛，胥宇建，等.大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)及植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（3）：139-143.

[3]姜鳳英，馮輝，王超楠.小白菜小孢子培養(yǎng)胚狀體的誘導(dǎo)[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（5）：763-765.

[4]吳藝飛，丁茁荑，肖杰，等.菜薹小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的影響因素研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（19）：16-19.

[5]申書興，趙前程，劉世雄，等.四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（4）：232-237.

[6]包美麗，付穎，鄭鵬婧，等.黃心春結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（4）：417-421.

[7]成妍，班青宇，王倩，等.不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)及再生植株的倍性鑒定 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（2）：25-29.

[8]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.提高大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)率的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（6）：34-37.

[9]Letarte J,Simion E,Miner M,et al．Arabinogalactans and arabinogalactan-protein induce embryogenesis in wheat (Triticum aestivumL．)microspore culture [J].Plant Cell Rep,2006,24:691-698.

[10]王愛(ài)杰，章云，劉洋，等.AG和AGPs對(duì)大白菜和普通白菜（小白菜）小孢子胚狀體誘導(dǎo)及成苗的影響[J].中國(guó)蔬菜，2012（4）：62-66.

Dissociative Microspore Culture of AnhuiPorphyra haitanensisand Establishment of Plant Regeneration System

QIN Yanmei,WANG Mingxia,JIANG Haikun,YAN Congsheng, WANG Yan,TIAN Hongmei,ZHANG Qi'an,FANG Ling
(Horticultural Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031)

The microspore embryogenic impact factors including genotypes,6-BA and AG the effect of 6-BA on plant regeneration were studied using the six AnhuiPorphyra haitanensiscultivars as the materials.The results showed that the frequency of microspore-induced embryos varied remarkably among the different genptyes cultivars,and embryos were included from three cultivars.H-4 had the highest induction rate with the frequency of 8.76 embryos per bud.Adding 0.2 mg/L 6-BA or 10 mg/L AG to NLN-13 medium could promote the embryos induction,and the latter was more obvious.1 mg/L 6-BA added to MS medium could improve the plant regeneration rate of AnhuiP.haitanensisembryos.

Porphyra haitanensis;Microspore culture;Inductivity;Embryoid;Plant regeneration

S634.4

A

1001-3547（2017）06-0029-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.06.012

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（15B0338）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（GARS-25-G-18）

秦艷梅（1987-），女，研究實(shí)習(xí)員，從事蔬菜育種工作，電話：15855132330

方凌，通訊作者，研究員，從事蔬菜品種選育及產(chǎn)業(yè)化研究

2016-12-13