鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表達(dá)研究

李杰，李雙，于盛竹，劉歡歡，張會(huì)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表達(dá)研究

李杰1，李雙1，于盛竹2，劉歡歡1，張會(huì)1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

研究將鳳尾菇漆酶基因Lac4（GeneBank登錄號(hào)AJ507327.1）cDNA克隆到表達(dá)載體pSZHG10-6-2上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入黑曲霉CICC2462中，篩選得到糖化酶基因glaA位點(diǎn)發(fā)生同源重組的黑曲霉轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵后取上清液作SDS-PAGE檢測(cè)、酶活測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)和酶穩(wěn)定性分析，研究重組漆酶對(duì)染料脫色影響。結(jié)果表明，成功分泌表達(dá)重組漆酶rLac4，其活性在第9天時(shí)達(dá)酶活最高峰1 211U·L-1；酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)溫度為60℃、pH為4.5，且在10～30℃及pH 5.0～6.0穩(wěn)定性較好。最適反應(yīng)條件下，重組漆酶對(duì)ABTS的Km為0.142mmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vm為0.693mmol·L-1·m in-1·mg-1；通過重組漆酶研究4大類染料脫色能力，發(fā)現(xiàn)ABTS為介體時(shí)該漆酶對(duì)三苯基甲烷類孔雀綠脫色可達(dá)44%，雜環(huán)類中性紅、偶氮類甲基橙脫色率分別13%和11%，而對(duì)蒽醌類活性亮藍(lán)（RBBR）降解作用不明顯，重組漆酶對(duì)孔雀綠的脫色效率具有較大應(yīng)用價(jià)值潛力，對(duì)含三苯基甲烷染料廢水處理應(yīng)用前景良好。

漆酶；黑曲霉；異源表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；脫色

李杰,李雙,于盛竹,等.鳳尾菇（Pleurotus sajor-caju）漆酶Lac4基因在黑曲霉中表達(dá)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(4): 7-14.

Li Jie,Li Shuang,Yu Shengzhu,et a l.Expression of Pleuro tus sajor-caju laccase Lac4 in Aspergillus n iger[J].Journa l of NortheastAgricultura lUniversity,2017,48(4):7-14.(in Chinese w ith English abstract)

漆酶（Laccase EC.1.10.3.2）是含銅多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶（Bluemulticopper oxi?dase，BMCOs）家族，最早在日本漆樹（Rhusvernic?ifera）汁液中發(fā)現(xiàn)[1]。廣泛分布于自然界昆蟲、高等植物、真菌和細(xì)菌中，其中白腐真菌是重要漆酶生產(chǎn)菌[2]，但天然漆酶產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且需要外加酚類化合物誘導(dǎo)產(chǎn)酶，限制漆酶工業(yè)化生產(chǎn)[3-5]。漆酶可降解木質(zhì)素和多種有機(jī)毒物，在食品、紡織、紙漿造紙、木材加工、生物合成、能源等方面應(yīng)用前景廣泛。因此，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、價(jià)廉的漆酶成為研究熱點(diǎn)[6]。

目前，不同漆酶基因已成功異源表達(dá)于多個(gè)原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中[7]。宿主體系包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[8-9]、甲醇畢赤酵母（Pich?iamethanolica）[10]、黑曲霉（Aspergillusniger）[11]、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）[12]、灰蓋鬼傘菌（Copri?nopsis cinerea）[13]、米曲霉（Aspergillussoryzae）[14]等。漆酶來(lái)源不同其結(jié)構(gòu)與功能不同，表達(dá)效果存在差異[15]。

優(yōu)化不同漆酶基因表達(dá)方法，如選擇合適啟動(dòng)子與信號(hào)肽、表達(dá)宿主、優(yōu)化發(fā)酵溫度、培養(yǎng)條件等，可建立高效異源表達(dá)系統(tǒng)[16]。但目前漆酶基因異源表達(dá)仍不理想，常用的大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母仍無(wú)法高效表達(dá)漆酶[17]。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，黑曲霉（Aspergillusniger）作為絲狀真菌中重要蛋白生產(chǎn)宿主[18]，憑借強(qiáng)大蛋白分泌能力和優(yōu)秀生物安全性，具有類似高等生物糖基化系統(tǒng)，成為重要的重組蛋白表達(dá)宿主和酶制劑生產(chǎn)菌。

本試驗(yàn)在分析鳳尾菇漆酶基因Lac4（GeneBank No.AJ507327.1）編碼的蛋白質(zhì)序列基礎(chǔ)上，通過基因工程手段構(gòu)建自帶信號(hào)肽的Lac4基因黑曲霉表達(dá)載體pSZHG10-6-2-lac4，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化于黑曲霉CICC2462，旨在構(gòu)建一株可分泌表達(dá)漆酶黑曲霉重組菌株。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物作酶學(xué)性質(zhì)和染料脫色效率研究，為進(jìn)一步改造和應(yīng)用漆酶提供參考[19]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

黑曲霉CICC2462、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌AGL1，基因Lac4，質(zhì)粒pSZHG10-6-2由由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)絲狀真菌遺傳工程教研室保存。PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)鳳尾菇基因組中漆酶基因Lac4序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Sequencesof prim er

1.1.2 主要試劑

試驗(yàn)中限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，快速質(zhì)粒小提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、植物DNA基因組提取試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、氨芐霉素（Amp）、乙酰丁香酮（As）均購(gòu)自Sangon公司；2,2'-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）購(gòu)自Amresco公司；孔雀綠、中性紅、甲基橙、活性亮藍(lán)（RBBR）均購(gòu)自Biotopped公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建黑曲霉重組表達(dá)載體

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ酶切合成漆酶基因Lac4，將其基因片段切膠回收。用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、HindⅢ酶切載體pSZHG10-6-2，將載體片段切膠回收。將回收目的片段和載體片段按一定比例混合，加入T4 DNA Ligase（DNA連接酶），16℃連接1 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在卡那霉素（Kan）抗性篩選下雙酶切鑒定，得到重組表達(dá)載體pSZHG10-6-2-Lac4（見圖1）。

圖1 重組表達(dá)載體pSZHG10-6-2-Lac4構(gòu)建Fig.1 Construction of theexp ression vector pSZHG10-6-2-Lac4

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉

將鑒定正確重組質(zhì)粒pSZHG10-6-2-Lac4加到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，利用基因引物P1、P2作PCR驗(yàn)證，水為陰性對(duì)照，重組質(zhì)粒pSZHG10-6-2-Lac4為陽(yáng)性對(duì)照，得到pSZHG10-6-2-Lac4農(nóng)桿菌重組轉(zhuǎn)化子。再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到黑曲霉CICC2462中，培養(yǎng)3～5 d，觀察培養(yǎng)基上單菌落。

1.2.3 篩選及鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

將篩選培養(yǎng)基上黑曲霉單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取適量菌絲，打碎，涂到含ABTS的PDA平板上作初次篩選，陽(yáng)性菌株周圍出現(xiàn)淺綠色透明圈，經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得重組漆酶的黑曲霉表達(dá)菌株。

1.2.4 黑曲霉重組菌株表達(dá)

將鑒定正確的黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，250 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)4 d后吸取發(fā)酵上清，于13 000 r·min-1下離心10min，取上清液，作蛋白和酶活等檢測(cè)。

1.2.5 酶活測(cè)定

用0.5mmol·L-1的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）為反應(yīng)底物，在反應(yīng)體系為4mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）中反應(yīng)3min，加入適量稀釋倍數(shù)粗酶液，反應(yīng)溫度為30℃，420 nm下測(cè)定吸光值。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1μmoL底物所需酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。運(yùn)用以下公式計(jì)算漆酶的酶活。測(cè)定結(jié)果重復(fù)3次。

其中，V1—反應(yīng)液總體積（mL）；V2—酶液體積（mL）；ΔOD—單位時(shí)間（1min）內(nèi)吸光度OD變化值；Δt—單位反應(yīng)時(shí)間（1min）；ε420（ABTS）（摩爾消光系數(shù)）=3.6×104moL·cm-1。

1.2.6 重組漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究

①重組漆酶最適溫度和pH測(cè)定

取一定量漆酶發(fā)酵液，以ABTS為底物，在pH 4.5緩沖液中，分別在20～80℃（每隔10℃為一個(gè)梯度）下，反應(yīng)3min，檢測(cè)該酶相對(duì)酶活力，測(cè)得重組漆酶rLac最適反應(yīng)溫度。并在不同pH（3.0～7.5）醋酸-醋酸鈉緩沖液中，以最適溫度檢測(cè)該酶酶活力，確定重組漆酶最適pH[20]。具體方法參見1.2.5酶活力檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果重復(fù)3次。

②重組漆酶溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測(cè)定

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將漆酶發(fā)酵液在10～80℃（每隔10℃為一個(gè)梯度）下孵育2 h后，在最適溫度及pH下測(cè)定漆酶酶活力，以最大酶活為100%。pH穩(wěn)定性測(cè)定：重組漆酶粗酶液液置于在50mmol·L-1不同pH醋酸鹽緩沖液（pH 4.0～7.0，每隔0.5一個(gè)梯度）中，4℃保溫24 h，在最適條件下測(cè)定漆酶殘余活性確定pH穩(wěn)定性。測(cè)定結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vm測(cè)定

將底物ABTS配置不同濃度，濃度范圍0.25～2mmol·L-1，采用ABTS法，在最適pH和溫度下測(cè)定酶活力，利用雙倒數(shù)作圖法（Linewear-Bank）作非線性擬合，得到重組漆酶對(duì)ABTS米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速率Vm值[21]。

1.2.8 粗酶液對(duì)合成染料脫色研究

利用紫外-可見分光光度計(jì)在300～800 nm區(qū)間掃描，探討重組漆酶Lac4對(duì)4種工業(yè)染料降解作用。得到幾種染料最大吸收波長(zhǎng)：孔雀綠為558 nm；中性紅為527 nm；甲基橙為486 nm，；活性亮藍(lán)（BRBB）為591 nm[6]。脫色體系中加入50mmol·L-1（pH 4.5）醋酸-醋酸鈉緩沖溶液8.5m L、待降解染料0.5mL，0.01mmoL·L-1的ABTS作介體，最后加入重組漆酶酶液1mL啟動(dòng)反應(yīng)，在30℃搖床過夜（24 h），檢測(cè)4種染料吸光度值為A1;以未加Lac4漆酶反應(yīng)體系為空白對(duì)照，測(cè)其吸光度值A(chǔ)0。所有測(cè)量均重復(fù)3次取平均值。脫色率計(jì)算公

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉表達(dá)載體pSZHG10-6-2-lac4構(gòu)建

將酶切回收后Lac4基因片段和表達(dá)載體pS?ZHG10-6-2片段用T4DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)卡那抗性篩選出大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，對(duì)重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ雙酶切后得到4 300 bp的含目的基因片段，證明為陽(yáng)性克隆，成功構(gòu)建表達(dá)載體pSZHG10-6-2-lac4（見圖2）。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉

將已構(gòu)建的表達(dá)載體pSZHG10-6-2-Lac4通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1中，將其涂布在含有抗性可篩選出農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d直至長(zhǎng)出單菌落（見圖3）。

PCR鑒定抗性菌落，以水為陰性對(duì)照，重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，引物P1和P2熒光定量引物作PCR驗(yàn)證（見圖4）。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到215 bp目的條帶，與預(yù)期一致，表明目的片段成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌AGL1中。

圖2 表達(dá)載體pSZHG10-6-2-Lac4轉(zhuǎn)入大腸桿菌中雙酶切結(jié)果Fig.2 Doubleenzymesdigestion resu ltof exp ression vector pSZHG10-6-2-Lac4 transferred into E.coli

圖3 表達(dá)載體pSZHG10-6-2-Lac4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.3 Resu ltof pSZHG10-6-2-Lac4 transformants into AGL1

2.3 篩選黑曲霉轉(zhuǎn)化子

將農(nóng)桿菌和黑曲霉共培養(yǎng)，涂布于于含有乙酰丁香酮（AS）PDA固體培養(yǎng)基，2 d后在加有ABTS平板上作初次篩選，黑曲霉陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌株周圍出現(xiàn)綠色透明圈（見圖5）。

2.4 黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子鑒定

挑取綠色透明圈菌株，于液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)約5 d，提取重組菌株基因組，經(jīng)糖化酶引物P3、P4作PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物用Xba I和HindⅢ作雙酶切，以水為陰性對(duì)照，出發(fā)菌株和pSZHG10-6-2-Lac4重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，得出2 500 bp和1 400 bp條帶，鑒定結(jié)果為黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子（見圖6）。

圖4 pSZHG 10-6-2-Lac4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Resultsof PCR identification of Agrobacterium tumefacien tranformantsofpSZHG10-6-2-Lac4

圖5 pSZHG10-6-2-Lac4重組轉(zhuǎn)化子初次篩選結(jié)果Fig.5 Initialscreening resultsof iden tification pSZHG 10-6-2-Lac4 recombination

2.5 重組漆酶的SDS-PAGE檢測(cè)

將菌量足夠出發(fā)菌株與pSZHG10-6-2-lac4同源重組菌株分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，取上清作SDS-PAGE檢測(cè)，未見明顯目的蛋白條帶（見圖7）。

2.6 重組菌株漆酶Lac4酶活檢測(cè)

取發(fā)酵4～10 d上清液，按1.2.5方法檢測(cè)酶活力。結(jié)果如圖8所示，pSZHG10-6-2-Lac4重組菌株酶活力在第9天高達(dá)1 211 U·L-1，從第10天開始呈下降趨勢(shì)。而出發(fā)菌株Asp中未檢測(cè)到漆酶活性，說(shuō)明鳳尾菇漆酶Lac4基因在黑曲霉CICC2642中分泌表達(dá)。

圖6 pSZHG10-6-2-Lac4重組轉(zhuǎn)化子PCR酶切鑒定結(jié)果Fig.6 Doubleenzymesdigestion resu ltsof identification pSZHG10-6-2-Lac4 recombination positive transformantsby PCR

圖7 重組漆酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE of recombinant laccase

圖8 重組菌株pSZHG 10-6-2-Lac4誘導(dǎo)表達(dá)漆酶活性Fig.8 Enzymeactivity of laccaseof recombinantstrain pSZHG10-6-2-Lac4

2.7 重組菌株中重組漆酶學(xué)性質(zhì)分析

溫度和pH對(duì)酶活力影響見1.2.5，分別在不同溫度（20～80℃）和pH（3.0～7.5）下作酶活力檢測(cè)，探究重組菌株所產(chǎn)漆酶最適溫度（結(jié)果見圖9,10）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60℃酶活值最高，為該漆酶最適溫度。30～70℃酶活均較高，說(shuō)明其適合溫度范圍較大；pH 4.5時(shí)酶活力最高，為重組漆酶最適pH。重組漆酶在pH 4.0～5.0酶活較高。

圖9 溫度對(duì)酶活影響Fig.9 Effectof the tem peratureon enzymeactivity

圖10 pH對(duì)酶活影響Fig.10 Effect of pH on enzym eactivity

2.8 pSZHG10-6-2-Lac4重組菌株中重組漆酶穩(wěn)定性分析

重組漆酶熱穩(wěn)定性如圖11所示。10～30℃孵育2 h后，重組漆酶活性保持在80%以上，40℃處理2 h后，仍保留70%以上殘余酶活力，50℃時(shí)重組漆酶酶活損失較快，＞60℃無(wú)法檢測(cè)到漆酶活性。pH穩(wěn)定性如圖12所示。將發(fā)酵粗酶液置于不同pH（4.0～7.0）緩沖液中4℃環(huán)境下，24 h后檢測(cè)酶活變化。結(jié)果顯示，該重組漆酶在pH 5.0～6.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好且相對(duì)酶活均在80%以上，酶活損失較慢，其中pH為6時(shí)酶活最高、最穩(wěn)定。一般來(lái)說(shuō)，漆酶在pH＞4、溫度在20～40℃范圍內(nèi)相對(duì)較穩(wěn)定；在酸性條件[22]及＞50℃[23]時(shí)相對(duì)不穩(wěn)定，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致[24]。

圖11 溫度對(duì)漆酶穩(wěn)定性影響Fig.11 Effectof temperatureon enzymeactivity

圖12 pH對(duì)漆酶穩(wěn)定性影響Fig.12 EffectofpH on enzymeactivity

2.9 重組漆酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

重組漆酶Lac4氧化不同濃度ABTS（0.25～2 mmol·L-1），測(cè)定酶活力與底物濃度用利用Linewear-Bank作圖法[25]作非線性擬合，計(jì)算60℃時(shí)重組漆酶Lac4對(duì)ABTS米氏常數(shù)Km為0.142mmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vm為0.693mmol·L-1·min-1·mg-1。Km值越小，表明該漆酶對(duì)ABTS親和能力越強(qiáng)。

2.10 粗酶液對(duì)合成染料脫色

4種染料蒽醌類活性亮藍(lán)（RBBR）、雜環(huán)類中性紅、偶氮類甲基橙和三苯基甲烷類孔雀綠染料濃度為1mmol·L-1，加入等量漆酶1 mL，發(fā)現(xiàn)該漆酶單獨(dú)作用于染料降解時(shí)，脫色效果無(wú)明顯變化；當(dāng)ABTS為介體時(shí)，漆酶對(duì)孔雀綠脫色程度較高，反應(yīng)24 h后脫色率達(dá)44%，對(duì)中性紅和甲基橙脫色率為13%和11%，而對(duì)蒽醌類活性亮藍(lán)（RBBR）脫色不明顯。說(shuō)明重組漆酶對(duì)孔雀綠脫色效率較高，對(duì)含三苯基甲烷染料廢水處理應(yīng)用前景良好。

3 討論與結(jié)論

本研究建立的黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)具有分泌蛋白能力強(qiáng)、翻譯后加工機(jī)制完善、誘導(dǎo)條件簡(jiǎn)單、安全性高、適合于液態(tài)發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。利用該系統(tǒng)成功表達(dá)來(lái)源于鳳尾菇Lac4漆酶基因，搖瓶發(fā)酵最高酶活為1 211 U·L-1，與張銀波等[26-27]研究結(jié)果不同。出發(fā)菌株在相同條件下無(wú)法檢測(cè)漆酶活性，重組菌株在篩選平板上顯色清晰，說(shuō)明重組菌株成功分泌表達(dá)重組漆酶Lac4。SDS-PAGE未檢測(cè)到明顯蛋白條帶，一方面是重組漆酶表達(dá)量較低；另一方面可能是該酶糖基化位點(diǎn)較多，重組蛋白糖基化程度不同，形成彌散條帶，或被糖化酶背景蛋白帶掩蓋。綜上所述，該重組菌株表達(dá)重組漆酶蛋白量較低，但具有較高比酶活力。未來(lái)將進(jìn)一步優(yōu)化基因作密碼子和信號(hào)肽、重組菌株搖瓶培養(yǎng)條件，提高重組蛋白表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)漆酶高效異源表達(dá)[28]。

重組漆酶Lac4酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，雖然該酶最適溫度為60℃，＞60℃2 h后，無(wú)法檢測(cè)活性，可能是長(zhǎng)時(shí)間處于較高溫度使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。與裴佐蒂研究中大多數(shù)真菌漆酶最適溫度為25～50℃結(jié)果相符[29]。

通過4種染料降解試驗(yàn)表明，該重組漆酶無(wú)法獨(dú)自降解這4類染料，需ABTS作為介體發(fā)揮降解作用。漆酶脫色效果受酶活性、染料性質(zhì)及染料吸附狀態(tài)影響[30]。后期可從脫色體系中添加染料吸附劑或不同脫色介體等角度，對(duì)不同染料漆酶脫色，深入探索漆酶染料脫色應(yīng)用[31]。

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Expression of Pleurotus sajor-caju laccase Lac4 in Aspergillus niger/LI

Jie1,LIShuang1,YU Shengzhu2,LIU Huanhuan1,ZHANG Hui1(1.Schoo l of Life Sciences,Northeast Agricu ltural University,Harbin 150030,China;2.Schoo l of Resources and Environment,Northeast Agricu ltural University,Harbin 150030,China)

In the study,the laccase Lac4 gene(GeneBank login AJ507327.1)cDNA from Pleurotus sajor-caju had be cloned to expression vector pSZHG10-6-2,and through the method of agrobacterium mediated im port Aspergillus niger CICC2462,screening by homologous recombination in g laA loci homozygous transformation.After the fermentation was carried out,the supernatantwas subjected to SDSPAGE,enzymatic activity and enzymatic properties and enzym e stability.The effects of recombinant laccase on the decolorization of the dye were investigated.The results showed that the recombinant laccase rLac4 was successfu lly secreted and its activity reached the highest peak o f 1 211 U·L-1on the 9th day.The optim al temperature was 60℃,the optimum pH was 4.5,and the enzyme had good stability at10-30℃ and pH 5.0-6.0.Under the optimum reaction conditions,the Kmand Vmof recombinantprotein laccase w ith ABTS as the substrate were 0.142mmol·L-1and 0.693mm ol·L-1·m in-1·mg-1;In addition,the decolorization ability offour kinds of dyes by recombinant laccase was studied.Itwas found thatwhen the ABTS wasmediator,the lignase could decolorize 44%of the triphenylmethane peach green,the neutral red and azo methylOrange decolorization rates ofmethyl orange were 13%and 11%,respectively.The degradation effect of anthraquinone active b lue(RBBR)was notobvious,indicating that the recombinant laccase had great potentia l for the decolorization efficiency ofmalachite green.The wastewater treatment ofmethane dyes has a good app lication prospect.

laccase;Aspergillus niger;hetero logous exp ression;enzymatic properties;decolorization

Q815

A

1005-9369（2017）04-0007-08

時(shí)間2017-4-24 6:19:33[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0619.002.html

2017-03-14

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃重大項(xiàng)目（GA15B203）

李杰（1972-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ?。E-mail:lijie_neau@126.com