野葛和粉葛不同溶劑提取物清除DPPH自由基活性的比較

劉琳　李生茂　袁斌　舒波　張世鵬

[摘要]目的：比較野葛和粉葛清除DPPH自由基的活性。方法：分別用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚對野葛及粉葛藥材進行提取，DPPH法測定抗氧化活性并計算IC50。結(jié)果：野葛乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的IC50值分別是2.6334、17.5689、42.1171mg/mL（生藥），氯仿和石油醚提取物200mg/mL（生藥）濃度時DPPH自由基清除率分別為18.03%、9.48%。粉葛乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50值是12.4629mg/mL（生藥），而丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取物200mg/mL（生藥）濃度時對DPPH自由基清除率分別為45.97%、15.03%、10.82%、7.65%。結(jié)論：野葛和粉葛各溶劑提取物均具有不同程度的清除DPPH自由基的活性，活性大小順序均為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物，相同溶劑的提取物野葛清除DPPH自由基的活性較粉葛強。

[關(guān)鍵詞]野葛；粉葛；提取物；DPPH

葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，為中醫(yī)臨床常用藥之一，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒之功效。文獻報道，葛根含有異黃酮、葛酚苷、香豆素和三萜皂苷等類化學(xué)成分，具有降低血壓、減緩心率、心肌缺血保護、抗心律失常、抗氧化、降血糖和改善肝臟脂代謝等藥理作用。其中抗氧化是葛根重要的藥理活性之一，葛根提取物、異黃酮或葛根素等體外具有清除DPPH自由基、羥基自由基、氧自由基或超氧陰離子的作用，并可降低多種動物模型丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氧酶等的活性。

歷代醫(yī)家對葛根植物來源認識不一，豆科葛屬植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）ohwi）和甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）等的干燥根均作為葛根藥材使用，分別為葛根（野葛）和粉葛，并認為野葛側(cè)重于解肌透疹、升陽，粉葛偏于清熱解肌、生津止渴、醒脾解酒、解毒，《中國藥典》自2005年版開始亦將野葛和粉葛單列收載。現(xiàn)代研究顯示，野葛和粉葛化學(xué)成分和藥理作用均有一定的差異，但未見有二者抗氧化活性的比較研究。因此，本實驗采用DPPH法比較了野葛和粉葛不同溶劑提取物的抗氧化活性，以期為合理開發(fā)利用野葛和粉葛藥材提供一定的實驗依據(jù)。

1.儀器與材料

1.1儀器 島津1750紫外分光光度計（日本島津公司）；HH-2K4型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；KQ3200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Epoch微孔板分光光度計（美國BIOTEK公司）。

1.2試劑 1，1-二苯基苦基苯肼（批號：034K1071，sigma公司）；乙醇（批號：2013091301，成都市科龍化工試劑廠）；丙酮（批號：1511211，西隴化工股份有限公司）；乙酸乙酯（批號：20160110，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；氯仿（批號：2015012701，成都市科龍化工試劑廠）；石油醚（60～90℃，批號：2013092701，成都市科龍化工試劑廠），均為分析純。

1.3受試藥物 野葛和粉葛分別購于安徽亳州中藥材批發(fā)市場和四川南充蒼生大藥房，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊蘭講師鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi、甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根。

2.方法

2.1樣品溶液制備 取野葛或粉葛粗粉5份，每份1g，精密稱定，分別加入20mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚，超聲提取0.5h，濾過，濾液置水?。?0℃）揮盡溶劑，加甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，即得。

2.2DPPH溶液配制 精密稱取DPPH適量，加甲醇配置成110btmol/L的溶液，避光保存。

2.3提取物對DPPH自由基清除作用 參考文獻，取“2.1”項下各樣品溶液，用甲醇稀釋成不同濃度供試品溶液。取0.15mL供試品溶液與0.15mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置180min，517nm處測定吸收度Ai；同時測定0.15mL甲醇+0.15mL DPPH溶液的吸光度A0，6個復(fù)孔，按公式計算清除率：DPPH自由基清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率（Y）對藥物濃度（x）對數(shù)進行線性方程回歸，根據(jù)對數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時藥物的濃度（IC50）。

3.結(jié)果

3.1測定波長的選擇 分別觀察了DPPH、加入野葛乙醇提取物的DPPH、野葛及粉葛各溶劑提取物的甲醇溶液在200～700nm的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)DPPH甲醇溶液在517nm處有強吸收峰，在加入野葛乙醇提取物后，517nm處的峰值均明顯降低。野葛及粉葛乙醇、野葛丙酮和乙酸乙酯提取物的甲醇溶液在240～280nm和300～340nm處分別有較強的吸收峰和明顯的肩峰，而各溶劑提取物在517nm處沒有吸收，故選擇517nm作為測定波長。見圖1。

3.2樣品測定 野葛和粉葛的5種溶劑提取物對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，并隨濃度的增加清除活性增強。兩種葛根藥材不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的強弱順序均為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物，其中野葛乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物提取物具有較強的清除DPPH自由基的活性，IC50值分別是2.6334、17.5689、42.1171mg/mL（生藥），氯仿和石油醚提取物則清除活性較弱，200mg/mL（生藥）濃度時對DPPH自由基清除率分別為18.03%、9.48%（未測出IC50值）。而粉葛乙醇提取物具有較強的清除DPPH自由基的活性，IC50值分別是12.4629mg/mL（生藥），而丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取物清除活性較弱，200mg/mL（生藥）濃度時對DPPH自由基清除率分別為45.97%、15.03%、10.82%、7.65%（未測出IC50值）。兩種葛根藥材相同溶劑的提取物清除DP-PH自由基的活性比較，則是野葛提取物清除自由基的活性強于粉葛，結(jié)果見圖2。

4.討論

體外評價抗氧化能力的方法有很多，常用的有ORAC法、ABTS法、DPPH法、羥基自由基清除能力法、超氧陰離子清除能力法、FRAP法、FC法、DNA氧化損傷法、脂質(zhì)過氧化法、紅細胞溶血法和線粒體腫脹法等。其中，DPPH法具有簡便快速等特點，為目前應(yīng)用最廣泛的一種體外抗氧化活性評價方法，其原理為DPPH自由基在甲醇（乙醇）溶劑中呈紫色，在515～520nm范圍內(nèi)有最大吸收，當(dāng)自由基清除劑提供電子與DPPH自由基的孤電子配對時，DPPH自由基會褪色，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，故可以通過吸光度的變化進行定量分析。

實驗在采用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚對野葛和粉葛分別進行提取獲得不同極性溶劑提取物的基礎(chǔ)上，通過DPPH法比較了抗氧化活性的差異。結(jié)果表明，野葛和粉葛各溶劑提取物均具有不同程度的清除DPPH自由的活性，并呈明顯的量效關(guān)系。同時，隨提取溶劑極性的降低，清除活性減弱，其活性的強弱順序依次為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物。而兩種藥材相同溶劑提取物清除DPPH自由的活性也有明顯差異，野葛抗氧化的活性明顯優(yōu)于粉葛。進一步對各提取物的紫外光譜數(shù)據(jù)分析并結(jié)合文獻報道，發(fā)現(xiàn)野葛及粉葛乙醇、野葛丙酮和野葛乙酸乙酯提取物的甲醇溶液具有典型的異黃酮類成分的紫外光譜特征，推測其所含異黃酮類成分可能是野葛及粉葛發(fā)揮清除DPPH活性的主要成分。