黃精多糖對高脂飼料誘發(fā)糖尿病小鼠糖代謝功能的影響

賈璐+石潔+段志倩+董瑞萍+萬盟+鄭建勇

[摘要] 目的 建立小鼠高血糖模型，在此模型上考察黃精多糖（PSP）對于糖尿病小鼠體重、血糖、胰島素、糖耐量、一氧化氮（NO）水平的影響。 方法 小鼠按照體重隨機(jī)建立正常對照組和模型組（Model組），Model組以高脂飼料喂養(yǎng)50周，造成糖尿病小鼠模型。造模成功后，從正常對照組中隨機(jī)選取10只小鼠作為Control組，將Model組按照體重隨機(jī)分為高脂飼料組（HFD組）和黃精多糖組（PSP組），每組各10只。PSP組用25 g/L黃精多糖水溶液、500 mg/kg劑量、每日1次灌胃給藥8周，同時(shí)Control組和HFD組給予等量蒸餾水，通過血糖儀、胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、Western-blot法檢測各組血糖值、糖耐量、胰島素水平、肝臟胰島素受體（IRS-2）表達(dá)以及肝臟NO水平的影響。 結(jié)果 Model組小鼠空腹血糖值、體重顯著高于Control組，提示模型成功。PSP組小鼠與HFD組相比，空腹血糖值和胰島素水平顯著降低（P < 0.05），同時(shí)胰島素受體IRS-2的表達(dá)量明顯增加（P < 0.05），并在一定程度上降低了肝組織NO水平。 結(jié)論 該糖尿病小鼠模型穩(wěn)定，同時(shí)具有空腹高胰島素血癥的特點(diǎn)，對研究胰島素抵抗的發(fā)病尤為適用。通過PSP對該模型的干預(yù)，顯示PSP可以降低高血糖小鼠空腹血糖值、空腹胰島素水平，同時(shí)提高胰島素受體的表達(dá)，并對高血糖環(huán)境下的高氧化應(yīng)激狀態(tài)有一定的抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 高脂飼料；糖尿病；小鼠；黃精多糖；胰島素；氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R587；R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（b）-0024-05

The influence of polygonatum polysaccharide on function of glucose metabolism of high-fat-diet-fed diabetic mice

JIA Lu1 SHI Jie1 DUAN Zhiqian1 DONG Ruiping1 WAN Meng2 ZHENG Jianyong1▲

1.Department of Quality Control， Nanjing Red Cross Blood Center， Jiangsu Province， Nanjing 210003， China； 2.Department of Pharmacy， Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University， Jiangsu Province， Nanjing 210006， China

[Abstract] Objective To establish mice model with hyperglycemia， and to investigate the effects of polygonatum polysaccharide （PSP） on the body weight， blood glucose， insulin， glucose tolerance and nitric oxide （NO） in this mice model. Methods Mice were randomly divided into normal control group and model group by weight. Model group was given high-fat diet for 50 weeks， resulting in diabetic mice. Then 10 mice were selected as control group from normal control group， and the model group was randomly divided into high fat diet （HFD） group and PSP group by weight， with 10 mice in each group. PSP group was administrated with 25 g/L PSP solution， 500 mg/kg. once per day， for 8 weeks. Control group and HFD group were given the same volume of distilled water. Then the glucose levels， glucose tolerance， insulin levels， hepatic insulin receptor （IRS-2） expression and NO levels in the liver were investigated using blood glucose meter， insulin enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） kits or Western-blot assay. Results The fasting blood glucose levels and weights of model group were significantly higher than those of control group， suggesting that the model was successful. Compared with that of HFD group， the fasting glucose levels and insulin levels of PSP group were significantly reduced （P < 0.05）， and the IRS-2 expression was showed significantly increased （P < 0.05） and NO was decreased to a certain degree by PSP intervention. Conclusion The diabetic mice model is stable， and it has the characteristics of fasting hyperinsulinemia， which is applicable for the study of the incidence of insulin resistance. PSP intervention can decrease the fasting blood glucose level， fasting insulin level， increase insulin receptor expression， and inhibit oxidative stress to a certain extent under high glucose environments in diabetic mice.

[Key words] High fat diet； Diabetes； Mice； Polygahatous polysaccharides； Insulin； Oxidative stress

我國傳統(tǒng)藥物黃精有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤肺益腎之功效。黃精多糖（polygahatous polysaccharides，PSP）是黃精中的重要成分，有研究表明，PSP具有調(diào)血脂、抗缺氧損傷、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[1-2]。糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，目前尚無完全根治糖尿病的方法，嚴(yán)重危害人類的健康，且近年來隨著全球老齡化趨勢的加劇，患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增趨勢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃精多糖對糖尿病及其并發(fā)癥也有明確的療效[3]，但其機(jī)制尚未有定論。因此，本文著重探討黃精多糖對高脂飼料喂食誘發(fā)的糖尿病小鼠模型的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡BALB/c小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK2008-0011），雄性，SPF級，（18±2）g。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，保持室溫在（22±2）℃，相對濕度50%～70%。

1.2 藥物及儀器

PSP（江蘇省中醫(yī)院制劑部提供20151123）；血糖試紙（德國羅氏診斷有限公司，批號：3907441）；NO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所150915）；胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海朗頓生物技術(shù)有限公司BPE10113）。TP-5000A電子天平（湘儀天平儀器廠）；血糖檢測儀（德國羅氏診斷有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（ThermoElectron）；T25超聲勻漿機(jī)（德國IKA）；Bio-rad電泳及成像系統(tǒng)（美國Bio-rad）。

1.3 動(dòng)物模型的建立與分組給藥

模型建立：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素對小鼠胰島素敏感性及脂肪因子有影響[4]，故選用雄性BALB/c小鼠50只，飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，自由飲水取食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：①正常對照組15只，予以普通飼料喂養(yǎng)。②模型組（Model組）35只，予以高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飲食的配方參照胰島素抵抗模型飼料配方，所含熱量成分為碳水化合物35%、脂肪45%、蛋白質(zhì)20%[5]。每周稱重并記錄，兩組以相應(yīng)飼料喂養(yǎng)50周后，尾尖取血，血糖儀檢測血糖值，Model組血糖值≥10 mmol/L并且顯著高于正常對照組，判定為造模成功。

分組給藥：從正常對照組中隨機(jī)選取10只小鼠作為Control組。從模型組中隨機(jī)選取10只小鼠為高脂飼料組（HFD組），隨機(jī)選取10只小鼠為PSP組，PSP組配制25 g/L黃精多糖水溶液，按照500 mg/kg劑量灌胃給藥，其余兩組灌胃給予等量蒸餾水。三組給藥時(shí)間均為8周。

1.4 小鼠糖耐量的檢測

連續(xù)給藥7周后，禁食16 h，一次性腹腔注射10%葡萄糖溶液，注射容積為0.2 mL/10 g，于0、15、30、60、120 min時(shí)，取尾尖血測定血糖值，進(jìn)行糖耐量檢測并記錄。

1.5 小鼠空腹血糖與胰島素水平的檢測

給藥第8周結(jié)束后，禁食16 h，取眼球后靜脈叢血測空腹血糖值。通過眼球后靜脈叢取血100 μL，在4℃條件下4000 r/min離心10 min，離心半徑9.2 cm。冰上分離血清。采用新鮮血清盡快進(jìn)行胰島素的ELISA檢測。

1.6 小鼠血清NO水平的檢測

給藥第8周結(jié)束，空腹血糖與胰島素水平的檢測結(jié)束后。處死小鼠，取肝臟，稱重，置于其重量5倍的4℃組織勻漿緩沖液勻漿，勻漿經(jīng)18 000 r/min離心15 min，離心半徑6.2 cm。取上清液備用，采用ELISA檢測肝組織NO水平，然后以Control組數(shù)值為基值，其余各組與其進(jìn)行比較，結(jié)果作為相對的NO水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 胰島素受體-2（IRS-2）表達(dá)的檢測

肝臟中IRS-2蛋白的表達(dá)采用Western-blot檢測，取50 mg肝臟組織加入蛋白裂解液，得到肝臟組織蛋白質(zhì)；取變性后的蛋白樣品50 μg電泳3 h，采用濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，5% BSA溶液封閉過夜；洗滌后先后與一抗抗體、過氧化物酶標(biāo)志的二抗及顯色底物孵育；用ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色、顯影、定影、掃描。然后以Control組數(shù)值為基值，其余各組與其進(jìn)行比較，結(jié)果作為相對的IRS-2蛋白表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖代謝異常小鼠模型的建立

2.1.1 糖代謝異常小鼠模型體重的變化 設(shè)置正常對照組、Model組，分別以普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，其他生長條件一致。期間密切關(guān)注小鼠的生長狀態(tài)，每周稱量體重。在模型建立的42周時(shí)，兩組體重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），并且穩(wěn)定保持至50周。見圖1。

2.1.2 糖代謝異常小鼠空腹血糖的變化 正常對照組與Model組小鼠持續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)50周后，禁食16 h，取尾尖血檢測空腹血糖并再次分組，記錄初始血糖值。PSP組與HFD組血糖水平顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.2 PSP對糖代謝異常小鼠的影響

2.2.1 PSP對糖代謝異常小鼠體重的影響 分組后，各組小鼠持續(xù)給予藥物8周并記錄體重變化，結(jié)果顯示，PSP組與HFD組顯著高于Control組（P < 0.05），但PSP組與HFD組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.2.2 PSP對糖代謝異常小鼠糖耐量的影響 藥物干預(yù)7周后，進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)。腹腔注射10%葡萄糖溶液后，三組小鼠血糖均先升高，30 min時(shí)檢測到最高點(diǎn)，60 min開始檢測出逐步下降。初始血糖值HFD組、PSP組均顯著高于Control組（P < 0.05）。與HFD組比較，PSP組顯著降低15、30、60、120 min時(shí)間點(diǎn)的血糖值（P < 0.05）。見圖4。

2.2.3 PSP對糖代謝異常小鼠空腹血糖與胰島素水平的影響 各組小鼠持續(xù)給予藥物8周后，禁食16 h，取眼球后靜脈叢血檢測空腹血糖及血清胰島素水平。PSP組與HFD組血糖水平均顯著高于Control組（P < 0.05）。與HFD組比較，PSP組小鼠空腹血糖值顯著降低（P < 0.05）。見圖5。與HFD組比較，PSP組血清胰島素水平顯著降低（P < 0.05）。見圖6。

2.2.4 PSP對糖代謝異常小鼠肝組織NO水平的影響 采用ELISA試劑盒檢測各組小鼠肝組織勻漿中NO水平，并以Control組數(shù)值為基值，取比較后比值分析。HFD組與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；PSP組與Control組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。PSP組比值低于HFD組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖7。

2.2.5 PSP對胰島素受體IRS-2表達(dá)的影響 與Control組比較，HFD組、PSP組的IRS-2蛋白表達(dá)量均有顯著降低（P < 0.05），但PSP組顯著高于HFD組（P < 0.05）。見圖8。

3 討論

本研究首先通過高脂飼料喂養(yǎng)的方式建立糖尿病小鼠動(dòng)物模型，再以PSP干預(yù)的方式，考察其對于糖尿病小鼠的影響。目前文獻(xiàn)多采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)的方式造成2型糖尿病模型[6]，但是此為化學(xué)方法所致，存在局限性。課題組用高脂飼料喂食小鼠42周，正常對照組與Model組體重出現(xiàn)差異，但是空腹血糖沒有差異。而繼續(xù)高脂喂食到50周，出現(xiàn)顯著的空腹血糖異常，同時(shí)表現(xiàn)出空腹高胰島素血癥。高胰島素血癥被認(rèn)為是胰島素抵抗的主要血清學(xué)標(biāo)志[7]。此模型有助于2型糖尿病病理發(fā)生的研究，尤其對胰島素抵抗的探究較為適用。

黃精有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤肺益腎之功效，主要含有多糖、甾體皂苷、蒽醌類化合物等化合物[8]，其中PSP是其主要藥效活性物質(zhì)。前期報(bào)道PSP可以降低2型糖尿病大鼠血糖及胰島素抵抗，同時(shí)，PSP可能為糖基化損傷的抑制劑，其能抑制鏈脲佐菌素所致胰腺的免疫損傷及自由基損傷，從而改善胰島的分泌功能[9]。對于糖尿病的并發(fā)癥，PSP也有一定的作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，PSP可以減輕高脂飼料引起的空腹血糖及胰島素水平的異常升高。IRS-2通過類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）調(diào)控脂質(zhì)合成，IRS-2下調(diào)可使SREBP-1脂肪酸合成酶基因表達(dá)增加。SREBP還可干擾與IRS-2啟動(dòng)子結(jié)合的反式因子，直接抑制IRS-2的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝糖原合成減少，脂肪合成增加[12]。陳世清等[13]通過長期喂食大鼠高脂飼料，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物肝臟IRS-2的mRNA表達(dá)和蛋白水平分別降低了30%和27%。本研究結(jié)果與其一致，而PSP可以上調(diào)IRS-2的表達(dá)，提示PSP可以改善肥胖和高血糖引起的胰島素抵抗。

在病理狀態(tài)下，過量的NO主要發(fā)揮細(xì)胞抑制與毒性效應(yīng)。近年來研究表明，高血糖對細(xì)胞組織中NO的合成與釋放有明顯影響[14-15]。前期文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿病、代謝綜合征及胰島素抵抗患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高[16]。糖尿病的發(fā)病與機(jī)體的抗氧化水平密切相關(guān)，而PSP能夠在一定程度上糾正四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清和肝臟中超氧化物歧化酶以及丙二醛含量的異常變化[17]。本研究中的糖尿病模型小鼠NO水平也顯著升高，造成了氧化水平的異常，與文獻(xiàn)相符；而PSP可以降低NO水平，但是沒有顯著差異。

綜上所述，PSP可以改善血糖與胰島素水平，并提高IRS-2的表達(dá)量，對治療2型糖尿病有積極的意義，同時(shí)，其對機(jī)體氧化應(yīng)激水平也有影響，可能與抑制NF-κB-iNOS-NO氧化應(yīng)激通路相關(guān)[18]，結(jié)果尚需進(jìn)一步研究證明。

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