離子色譜-抑制電導(dǎo)、紫外串聯(lián)檢測(cè)肉類產(chǎn)品中的生物胺

朱作藝，張 玉，王君虹，黎天天，李 雪，王 偉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 320021；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

離子色譜-抑制電導(dǎo)、紫外串聯(lián)檢測(cè)肉類產(chǎn)品中的生物胺

朱作藝1,2，張 玉1,2，王君虹1,2，黎天天1，李 雪1,2，王 偉1,2*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 320021；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建培育基地，浙江 杭州 310021)

建立1種陽(yáng)離子交換色譜分離，抑制型電導(dǎo)-紫外串聯(lián)檢測(cè)法測(cè)定肉類產(chǎn)品中腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺、精胺、酪胺等7種生物胺的方法。樣品經(jīng)甲烷磺酸溶液提取，乙腈沉淀蛋白后，采用IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保護(hù)柱和IonPac CS17 (250 mm×4 mm) 分析柱進(jìn)行分離，采用甲基磺酸溶液作為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。結(jié)果表明，在最佳色譜條件下，7種生物胺能達(dá)到較好的分離效果，在一定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，方法檢出限在0.35～3.16 mg·kg-1，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.1% (n=6)。采用該方法對(duì)風(fēng)干牛肉、小黃魚及帶魚樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品加標(biāo)回收率在88.2%～108.8%。該方法簡(jiǎn)單、方便，具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，適用于各肉類產(chǎn)品中多種生物胺的同時(shí)測(cè)定。

離子色譜； 生物胺； 抑制電導(dǎo)； 紫外； 肉類產(chǎn)品

生物胺是一類低分子量含氨基化合物的總稱，可看作是氨分子上1～3個(gè)氫原子被烷基或芳香基所取代得到的物質(zhì)。按化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)分類，生物胺可分為脂肪族(尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)、雜環(huán)族(組胺、色胺等)等。也可將其分為單胺(酪胺、組胺、苯乙胺、色胺等)與多胺(腐胺、精胺、亞精胺等)。

食品中的生物胺主要來(lái)源于游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基形成的產(chǎn)物。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，部分生物胺是通過(guò)醛酮的胺化作用形成的[1-2]。生物胺廣泛存在于富含氨基酸、蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品、肉制品和發(fā)酵制品中，如干酪、酒類、發(fā)酵香腸、調(diào)味品等[3-9]。通常腐敗變質(zhì)的食品中含高水平的生物胺。

生物胺作為生物體內(nèi)正常的生理組分，適量的生物胺對(duì)維持機(jī)體正常生理功能具有重大意義。生物胺作為蛋白、核酸、激素的前體物質(zhì)，與生物體中蛋白質(zhì)、核酸、激素的合成有關(guān)；同時(shí)一定量的色胺、組胺、精胺、尸胺等在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力、控制血壓、消除自由基等方面具有顯著作用。但當(dāng)人體攝入過(guò)量的生物胺時(shí)，會(huì)引起頭疼、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可能危及生命[10]。生物胺中毒性最大的是組胺，毒性次之的酪胺則易引起偏頭痛和高血壓等不適反應(yīng)。生物胺中的尸胺和腐胺雖然毒性較小，但是能抑制組胺和酪胺代謝酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性。同時(shí)尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等易與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌性物質(zhì)亞硝胺[11]。

生物胺分析檢測(cè)方法包括分光光度法、熒光測(cè)定法、薄層層析法、高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等[12]。分光光度法與熒光測(cè)定法只用于檢測(cè)較受重視的生物胺，如組胺和酪胺。目前，色譜法是最常用的生物胺分析檢測(cè)方法[13-17]。食品中生物胺的測(cè)定主要存在兩方面的困難：1)樣品基質(zhì)復(fù)雜，一些含量水平低的生物胺易被樣品中的其他組分干擾；2)生物胺分子量小，絕大多數(shù)生物胺本身既沒有熒光特性，也沒有特異的紫外吸收基團(tuán)，因此多數(shù)檢測(cè)方法如高效液相色譜法、氣相色譜法需要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣復(fù)雜的衍生化處理，同時(shí)還存在副產(chǎn)物的干擾。離子色譜是液相色譜的一種，可用于分析陰陽(yáng)離子、極性及部分弱極性的有機(jī)化合物，具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好、樣品用量少等特點(diǎn)。生物胺在酸性溶液中呈陽(yáng)性，帶正電荷，可用陽(yáng)離子色譜柱進(jìn)行分離。與高效液相法相比，離子色譜法檢測(cè)生物胺不需要衍生過(guò)程，方法簡(jiǎn)單，減少了衍生化帶來(lái)的干擾和衍生物不穩(wěn)定等問(wèn)題，從而使分析方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性得到提高。目前離子色譜法測(cè)定生物胺主要通過(guò)抑制電導(dǎo)檢測(cè)，但仍有部分生物胺(如酪胺)利用電導(dǎo)無(wú)法檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)將抑制電導(dǎo)與紫外檢測(cè)器串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)具有電導(dǎo)信號(hào)生物胺(腐胺、尸胺、組胺等)與無(wú)電導(dǎo)信號(hào)生物胺(酪胺)的同時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Dionex ICS-3000離子色譜儀(美國(guó)戴安公司)，配有DP雙泵(帶脫氣裝置)，DC檢測(cè)/色譜單元(雙溫控區(qū))，EG淋洗液發(fā)生器單元；Chromeleon色譜工作站；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS檢測(cè)器(美國(guó)戴安公司)；AS自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)戴安公司)；Dionex IonPac CG17 (50 mm×4 mm)保護(hù)柱，Dionex IonPac CS17 (250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm電化學(xué)自再生抑制器；超純水系統(tǒng)；渦旋混勻器；離心機(jī)；0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾頭。

99%甲基磺酸(MSA，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm-1去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)品為酪胺(Tyramine)、腐胺(Putrescine)、尸胺(Cadaverine)、組胺(Histamine)、苯乙胺(Phenylethylamine)、亞精胺(Spermidine)和精胺(Spermine)，均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

準(zhǔn)確稱取各生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，置于50 mL容量瓶中，用10 mmol·L-1的MSA定容至刻度，搖勻，分別配制成1 000 mg·L-1的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

分別取適量的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用10 mmol·L-1的MSA進(jìn)行稀釋，配制成一系列濃度的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 淋洗液配制

MSA (100 mmol·L-1)。取6.5 mL的99% MSA，用去離子水定容到1 L。

1.3 色譜條件

色譜柱為Dionex Ionpac CG17保護(hù)柱(50 mm×4 mm)和Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)；流動(dòng)相為MSA梯度淋洗液(程序見表1)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；抑制電流103 mA；電導(dǎo)檢測(cè)池溫度35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；進(jìn)樣量25 μL。

表1 淋洗液梯度程序

1.4 樣品前處理

樣品在勻漿機(jī)上徹底粉碎勻漿，取5 g待測(cè)樣品，加入50 mL的10 mmol·L-1的MSA，超聲提取30 min，冷凍離心機(jī)(溫度4 ℃，8 500 r·min-1)離心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈渦旋混勻，離心后取上層液體4 mL用去離子水稀釋到10 mL，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

生物胺是一類堿性含氮化合物，存在于肉制品基體內(nèi)部，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行充分的粉碎和勻漿后用酸溶液提取，將提取液在高速離心機(jī)上離心后取上清液稀釋。肉制品的上清液中含有大量的蛋白質(zhì)大分子，根據(jù)離子色譜的特點(diǎn)，必須先沉淀蛋白質(zhì)。由于乙腈的介電常數(shù)較小，沉淀蛋白質(zhì)的效率相對(duì)較高，而強(qiáng)酸和中性鹽的方法對(duì)樣品本身的pH干擾較大，同時(shí)會(huì)帶入其他干擾離子，因此用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑，操作方便，沉淀效果好。

2.2 流動(dòng)相選擇和梯度的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用Dionex Ionpac CS17弱陽(yáng)離子交換色譜柱，MSA作為淋洗液，在酸性流動(dòng)相條件下，不同種類的生物胺根據(jù)所帶電荷的差異、離子半徑的大小以及極化程度的不同進(jìn)行分離。在CS17陽(yáng)離子交換色譜柱上，初始設(shè)置淋洗液濃度為等度的12 mmol·L-1的MSA，尸胺和腐胺之間沒有達(dá)到基線分離，組胺保留時(shí)間及與其他組分之間的分離效果較好，而亞精胺、苯乙胺、精胺等保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因此對(duì)淋洗液的條件進(jìn)行了梯度優(yōu)化，將初始淋洗液濃度降到10 mmol·L-1的MSA，腐胺與尸胺在低濃度淋洗液條件下能達(dá)到較好的分離，在12 min后增加淋洗液濃度進(jìn)行梯度洗脫，按照表1中的甲烷磺酸淋洗液梯度條件能夠同時(shí)對(duì)7種生物胺進(jìn)行較好地分離(標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1)。由于酪胺經(jīng)過(guò)抑制后缺少電荷，無(wú)電導(dǎo)信號(hào)，而通過(guò)紫外檢測(cè)具有良好的信號(hào)，從而可實(shí)現(xiàn)酪胺與其他生物胺的同時(shí)測(cè)定。

A為抑制電導(dǎo)檢測(cè)；B為紫外檢測(cè)；1為腐胺，2為尸胺，3為組胺，4為亞精胺，5為苯乙胺，6為精胺，7為酪胺，圖2同圖1 生物胺的標(biāo)準(zhǔn)色譜

從圖1中可以看出，其中個(gè)別生物胺(苯乙胺)的峰較寬，主要原因是生物胺結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)或雜環(huán)等結(jié)構(gòu)，而離子交換樹脂的基體是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，這些結(jié)構(gòu)與色譜柱的基體具有相似相溶性，從而導(dǎo)致峰寬較寬。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

為了考察分析方法的線性關(guān)系及檢出限，將7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品用10 mmol·L-1的MSA稀釋得到一系列濃度，按照色譜條件1.3節(jié)對(duì)上述系列濃度進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)r和檢出限(信噪比S/N=3)等如表2所示。被測(cè)組分的峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好線性關(guān)系，且線性范圍寬，檢測(cè)限較低，適于樣品中低含量生物胺檢測(cè)分析。

2.4 方法的重現(xiàn)性

通過(guò)對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.3節(jié)色譜條件平行分析6次考察方法的重復(fù)性，其中7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1。試驗(yàn)結(jié)果表明，7種生物胺的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于4.1%(表2)，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 生物胺線性關(guān)系、檢出限及重現(xiàn)性

生物胺線性范圍/(mg·L-1)相關(guān)系數(shù)方法檢出限/(mg·kg-1)峰面積RSD/%腐胺0.1～1000.99900.351.8尸胺0.1～1000.99980.431.2組胺0.2～1000.99961.092.5亞精胺0.1～1000.99960.392.9苯乙胺0.5～1000.99991.763.6精胺0.1～1000.99910.562.6酪胺0.5～1000.99983.164.1

2.5 樣品測(cè)定及加標(biāo)回收率

按照1.4節(jié)樣品前處理和1.3節(jié)色譜條件對(duì)風(fēng)干牛肉、冰鮮小黃魚及帶魚樣品進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，其中風(fēng)干牛肉樣品及加標(biāo)色譜圖如圖2所示。通過(guò)在樣品中加入一定濃度的混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定3次，加標(biāo)回收率結(jié)果見表3，加標(biāo)回收率在88.2%～108.8%，RSD均小于4.8%，表明該方法符合樣品分析的要求。

3 小結(jié)

綜上所述，本方法采用陽(yáng)離子交換分離，抑制型電導(dǎo)檢測(cè)測(cè)定了肉類樣品中的腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺以及精胺，同時(shí)將電導(dǎo)檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器串聯(lián)，紫外作為電導(dǎo)檢測(cè)的補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)了多種生物胺與無(wú)電導(dǎo)信號(hào)的酪胺的同時(shí)檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單、方便，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，線性范圍寬，線性關(guān)系良好，方法具有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。該方法避免了其他色譜法復(fù)雜和煩冗的衍生過(guò)程，又可實(shí)現(xiàn)多種生物胺的同時(shí)檢測(cè)，適用于一系列復(fù)雜樣品基體中生物胺的測(cè)定。

圖2 風(fēng)干牛肉樣品(a)及加標(biāo)(b)色譜圖

生物胺風(fēng)干牛肉小黃魚帶魚測(cè)定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%測(cè)定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%測(cè)定量/(mg·kg-1)加標(biāo)回收率/%RSD/%腐胺37.2101.44.89.593.62.14.292.33.3尸胺10.0105.91.314.994.71.93.691.52.6組胺12.496.70.4-98.31.1-94.90.9亞精胺15.9108.80.95.2102.41.84.898.32.3苯乙胺-91.63.2-88.23.6-90.44.0精胺66.9101.32.013.6103.52.56.8105.72.2酪胺39.898.90.911.898.21.4-96.52.7

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2016-12-25

浙江省自然科學(xué)基金(LQ15C200006，LY15C200010)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31401495)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目

朱作藝(1987—)，女，助理研究員，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全，E-mail: zhuzuoyi2008@126.com。

王 偉，E-mail: wangwei5228345@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170407

TS251

B

0528-9017(2017)04-0572-05

文獻(xiàn)著錄格式：朱作藝，張玉，王君虹，等. 離子色譜-抑制電導(dǎo)、紫外串聯(lián)檢測(cè)肉類產(chǎn)品中的生物胺[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：572-576.