幽門螺桿菌相關(guān)性胃腺癌中IL-37的表達(dá)及意義

龔謀春，方曉明，姚 寧，劉慧慧，陳琪楓，劉桂寶

·論 著·

幽門螺桿菌相關(guān)性胃腺癌中IL-37的表達(dá)及意義

龔謀春，方曉明，姚 寧，劉慧慧，陳琪楓，劉桂寶

目的 探討白細(xì)胞介素37(IL-37)在幽門螺桿菌(HP)相關(guān)性胃腺癌[HP(+)胃腺癌]中的表達(dá)及意義。方法 選取2014年1月至2015年12月解放軍第117醫(yī)院收治胃腺癌78例(HP+ 46例、HP- 32例)，同期門診HP(+)胃潰瘍及HP(-)正?；颊吒?0例。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測各組血漿IL-37蛋白表達(dá)；Western blot檢測HP(+)和HP(-)胃腺癌組癌組織內(nèi)IL-37蛋白表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測HP(+)與HP(-)胃腺癌癌組織IL-37 mRNA表達(dá)。結(jié)果 ①各組血漿IL-37蛋白表達(dá)情況：HP(-)正常組與HP(-)胃腺癌組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)；HP(+)潰瘍組高于HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HP(+)胃腺癌組高于HP(+)潰瘍組、HP(-)正常組及HP(-)胃腺癌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。②胃腺癌組癌組織內(nèi)IL-37蛋白表達(dá)情況：HP(+)組高于HP(-)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。③胃腺癌組癌組織內(nèi)IL-37 mRNA表達(dá)情況：HP(+)組高于HP(-)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 HP感染后血漿IL-37升高，HP(+)胃癌組織內(nèi)IL-37蛋白及mRNA表達(dá)均升高；IL-37表達(dá)升高與HP(+)胃腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。

幽門螺桿菌；胃腺癌；白細(xì)胞介素37

幽門螺桿菌(HP)感染是人類最高發(fā)的慢性細(xì)菌感染之一，全世界范圍內(nèi)，約有半數(shù)人口感染HP。HP感染與胃腺癌關(guān)系密切，在1994年WHO就把HP列為胃腺癌I類致癌危險因素，感染者發(fā)病率較非感染者高3～6倍[1-2]。白細(xì)胞介素37(IL-37)在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中呈高表達(dá)，研究表明，IL-37具有強(qiáng)大抗炎能力，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子表達(dá)和機(jī)體免疫功能[3-5]。胃腺癌是一個與慢性炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤，我們檢測了IL-37在這類胃腺癌血漿、癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況，探討IL-37與HP相關(guān)性胃腺癌發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年1月至2015年12月在我科住院，有我院胃鏡檢查、14C呼氣試驗結(jié)果及手術(shù)標(biāo)本的胃腺癌78例[HP(+) 46例、HP(-) 32例]，同期門診HP(+)胃潰瘍及HP(-)正?；颊吒?0例，平均年齡為(61.8±6.0)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠，有影響全身的心血管、腎、肝等基礎(chǔ)疾病，有合并其他腫瘤，有其他自身免疫性疾病，6個月內(nèi)有手術(shù)、外傷史，6個月內(nèi)合并急慢性感染及有藥物使用史的患者。本研究方案經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象知情同意并簽署知情同意書。14C呼氣試驗及胃鏡結(jié)果由我院消化科內(nèi)鏡中心完成，胃腺癌診斷由我院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 取入選病例清晨空腹8 h以上靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min，收集上清，于-80 ℃冰箱保存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿IL-37水平，操作過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。IL-37 ELISA試劑盒購自瑞士Adipogen 公司，最低檢測濃度為10 pg/mL；胃癌組織切除離體后5 min內(nèi)取腫瘤中央無壞死及出血部位組織，癌旁組織距腫瘤5 cm左右，組織大小均約1 cm×0.5 cm×0.5 cm，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，立即置于液氮罐中保存，用于IL-37 mRNA水平和蛋白檢測。切除、清掃大體標(biāo)本送病理科檢查。

1.2.2 Western blot檢測組織IL-37蛋白的表達(dá)水平 組織標(biāo)本經(jīng)過蛋白樣品制備、蛋白定量、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體雜交、發(fā)光檢測后，結(jié)果以灰度值表示。檢測所用的IL-37一抗為兔抗人單抗隆抗體IgG購于美國Abcam公司。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)檢測組織IL-37 mRNA的表達(dá)水平 取備用的組織，組織經(jīng)過蛋白裂解液裂解、勻漿，TRIzol試劑法提取總RNA；最后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。相關(guān)引物委托上海生工完成，IL-37引物序列上游：5′-AGTGCTGCTTAGAAGACCCGG-3′，下游：5′-AGAGTCCAGGACCAGTACTTTGTG A-3′。以β肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，其引物序列上游: 5′-TGGCACTCCAGCACAATGAA-3′，下游:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應(yīng)體系為20 μL，進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，預(yù)變性，95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環(huán)。記錄循環(huán)閾值(Ct值)，以相對定量方法計算IL-37 mRNA的表達(dá)水平。

Western blot檢測IL-37蛋白表達(dá)，用ImageJ2x軟件分析蛋白條帶，IL-37蛋白相對含量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。RT-PCR檢測組織IL-37 mRNA表達(dá)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Band Leader 3.0凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，IL-37 mRNA的值用IL-37與β-actin掃描密度值之比表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組血漿IL-37蛋白表達(dá)情況 血漿IL-37蛋白水平由HP(-)正常組、HP(-)胃腺癌組、HP(+)潰瘍組、HP(+)胃癌腺組依次升高。HP(+)潰瘍組高于HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組，HP(+)胃腺癌組高于其他組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，見表1。

組別nIL-37HP(-)正常組3019.51±4.61*#HP(-)胃腺癌組3223.64±6.72*#HP(+)潰瘍組3066.11±20.92*HP(+)胃癌腺組4678.97±24.67與HP(+)胃癌腺組比較,*P<0.01;與HP(+)潰瘍組比較,#P<0.01

2.2 胃腺癌組癌旁組織及癌組織IL-37蛋白表達(dá)情況 HP(+)和HP(-)胃腺癌組癌旁組織及癌組織均有IL-37蛋白的表達(dá)，癌組織IL-37蛋白均高于癌旁組織，見圖1；分析條帶光密度值，計算各組IL-37蛋白與GAPDH光密度的比值，HP(+)胃腺癌組癌組織內(nèi)IL-37蛋白表達(dá)高于HP(-)胃腺癌組癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

1、3：HP(-)胃腺癌組癌旁組織及癌組織；2、4：HP(+)胃腺癌組癌旁組織及癌組織。GAPDH：內(nèi)參；IL-37：白細(xì)胞介素37

圖1 2組胃腺癌癌旁組織及癌組織內(nèi)IL-37蛋白電泳圖

組別nIL-37/GAPDHHP(-)胃腺癌組32 癌旁組織0.212±0.046 癌組織0.764±0.063*HP(+)胃癌腺組46 癌旁組織0.372±0.013 癌組織1.330±0.065*#與本組癌旁組織比較,*P<0.01;與HP(-)胃腺癌組癌組織比較,#P<0.01

2.3 胃腺癌癌組織內(nèi)IL-37mRNA表達(dá) HP(+)胃腺癌組癌組織IL-37 mRNA表達(dá)顯著高于HP(-)胃腺癌組，表達(dá)水平分別為(0.4787±0.0707)和(0.1817±0.0428)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

與HP(-)胃腺癌組比較，*P<0.01

圖2 HP(+)與HP(-)胃腺癌癌組織中IL-37mRNA表達(dá)

3 討 論

HP感染是人類最高發(fā)的慢性細(xì)菌感染之一，全世界范圍內(nèi)，約有半數(shù)人口感染HP。HP感染與胃腺癌關(guān)系密切，感染者發(fā)病率較非感染者高3～6倍。在1994年，WHO就把HP列為胃腺癌I類致癌危險因素。當(dāng)人體胃部黏膜表皮受到HP感染后容易造成局部區(qū)域細(xì)胞變性、壞死等，引起胃部組織出現(xiàn)萎縮、分化障礙，導(dǎo)致腸化生，甚至引起異型增生，最終演變?yōu)槲赶侔6]。因此，HP相關(guān)性胃腺癌是個與慢性炎癥密切相關(guān)性惡性腫瘤，這個過程是一個慢性反復(fù)的炎癥過程[7-8]。白細(xì)胞介素1(IL-1)家族被認(rèn)為是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要因子，可能與胃惡性腫瘤相關(guān)[9]。IL-37是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族中的一員，在體內(nèi)及體外均被證實能抑制多種促炎因子的表達(dá)，具有強(qiáng)大抗炎能力[10]。已有研究表明，IL-37在非小細(xì)胞肺癌中可抑制腫瘤血管生成的作用[11]，我們對IL-37在HP相關(guān)性胃癌之間的關(guān)系作了初步探討。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，HP(-)組和HP(-)胃腺癌組血漿IL-37表達(dá)無明顯差異，HP(+)潰瘍組血漿IL-37蛋白表達(dá)高于HP(-)組和HP(-)胃腺癌組?？梢哉J(rèn)為HP感染后胃組織存在慢性炎癥，血漿IL-37蛋白表達(dá)升高是機(jī)體炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。這與既往研究認(rèn)為IL-37表達(dá)在炎癥性疾病中表達(dá)增高相一致。我們還發(fā)現(xiàn)，HP(+)胃腺癌癌組織與HP(-)胃腺癌癌組織標(biāo)本相比，HP(+)胃腺癌組織內(nèi)IL-37蛋白及mRNA表達(dá)均升高，這提示從胃組織HP慢性感染開始至胃組織惡變的全過程中，均存在IL-37表達(dá)升高這一改變。我們也檢測了2組胃腺癌組癌組織與癌旁組織內(nèi)IL-37蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織中IL-37蛋白與癌旁組織相比均升高，可能提示胃組織發(fā)生惡變后，不管有無幽門螺桿菌感染，均存在有包括免疫細(xì)胞的浸潤在內(nèi)的炎癥性改變。

對IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)DC的活性研究發(fā)現(xiàn)，IL-37可顯著抑制經(jīng)LPS刺激后樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)活性，其機(jī)制為顯著狀少DC表面CD86和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHCⅡ)的平均表達(dá)量(由73%下降為47%)[4]。在HP感染的慢性炎癥過程中，病情有淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸化-異型增生-癌變的變化過程[12]。免疫監(jiān)視的缺失在組織發(fā)生惡變過程中起到至關(guān)重要。DC是免疫反應(yīng)起始環(huán)節(jié)，在免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的作用，隨著IL-37水平升高，DC活性的功能減弱，抑制了免疫細(xì)胞的趨化及關(guān)鍵的某些免疫反應(yīng)，可能是胃腺癌形成的因素之一。研究表明IL-37主要有兩條作用途徑：①分泌到胞外通過IL-18R發(fā)揮作用；②轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)與Smad3等因子相互作用影響多個因子的轉(zhuǎn)錄[3]。在對胃癌的發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Smad3基因是一個重要環(huán)節(jié)，敲除小鼠Smad3后發(fā)現(xiàn)，小鼠胃小彎側(cè)開始發(fā)生腸化生、侵襲性胃癌形成[13]。Smad3 過表達(dá)能顯著減少胃腺癌細(xì)胞的成瘤性，而表達(dá)減少則胃癌的發(fā)生率顯著增高[14-15]。因此，我們推測，HP(+)胃腺癌中IL-37升高，可能與Smad3這個胃癌早期形成過程中的關(guān)鍵性信號通路相互作用有關(guān)。本研究期間中，未獲得HP(-)正常胃組織標(biāo)本，因此未進(jìn)行正常胃組織與胃腺癌組織及癌旁組織IL-37蛋白與mRNA表達(dá)的比較。兩者關(guān)系需進(jìn)一步獲得標(biāo)本后驗證。

總之，HP相關(guān)性胃腺癌是與慢性炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤，IL-37作為重要的抗炎因子在HP的慢性感染過程中表達(dá)升高。HP(+)胃腺癌病例血漿IL-37蛋白表達(dá)均高于正常病例、HP(+)潰瘍病例及HP(-)胃腺癌病例，HP(+)胃腺癌癌組織內(nèi)IL-37表達(dá)高于HP(-)胃腺癌組織。因此，IL-37表達(dá)與HP相關(guān)性胃腺癌密切相關(guān)，在HP相關(guān)性胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制需進(jìn)一步研究。

[1] Conteduca V, Sansonno D, Lauletta G,etal. H. pylori infection and gastric cancer: state of the art (review)[J]. Int J Oncol, 2013,42(1):5-18.

[2] Meng W, Bai B, Sheng L,etal. Role of Helicobacter pylori in gastric cancer: advances and controversies[J]. Discov Med, 2015,20(111):285-293.

[3] Boraschi D, Lucchesi D, Hainzl S,etal. IL-37: a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family[J]. Eur Cytokine Netw, 2011,22(3):127-147..

[4] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA,etal. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity[J]. Nat Immunol, 2010,11(11):1014-1022.

[5] 張 燕, 熊 霞. IL-37及其與疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2015,35(4):549-553.

[6] Valenzuela MA, Canales J, Corvalán AH,etal. Helicobacter pylori-induced inflammation and epigenetic changes during gastric carcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(45):12742-12756.

[7] 蔡 慧, 丁一波, 馬立業(yè), 等. 炎癥信號網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵分子事件在胃癌進(jìn)化發(fā)育中的作用[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2016,18(3):290-293.

[8] 吳楠蝶, 魏 嘉, 劉寶瑞. 胃癌分子靶向治療的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2014,27(12):1318-1322.

[9] 向 瑜, 楊致邦, 陳 瀑, 等. 白細(xì)胞介素-1B和腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與胃潰瘍、胃癌易感性的相關(guān)性[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 2009,22(10):1010-1014.

[10] Chen HM, Fujita M. IL-37: a new player in immune tolerance[J]. Cytokine, 2015,72(1):113-114.

[11] Ge G, Wang A, Yang J,etal. Interleukin-37 suppresses tumor growth through inhibition of angiogenesis in non-small cell lung cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):13.

[12] 席銀雪, 宋 鑫, 陳 潔, 等. syndecan-1在胃黏膜癌變不同階段組織中的表達(dá)及意義[J]. 中華腫瘤雜志, 2007,29(3):193-196.

[13] Nam KT, O'Neal R, Lee YS,etal. Gastric tumor development in Smad3-deficient mice initiates from forestomach/glandular transition zone along the lesser curvature[J]. Lab Invest, 2012,92(6):883-895.

[14] Han SU, Kim HT, Seong DH,etal. Loss of the Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer[J]. Oncogene, 2004,23(7):1333-1341.

[15] 王運(yùn)濤, 吳小濤, 鄭啟新, 等. 轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad3促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實驗研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2007,20(7):689-692.

(本文編輯:葉華珍； 英文編輯：王建東)

IL-37 level in HP positive patients with gastric adenocarcinoma

GONG Mou-chun, FANG Xiao-ming, YAO Ning, LIU Hui-hui, CHEN Qi-feng, LIU Gui-bao

(DepartmentofGeneralSurgery,the117thHospitalofPLA，Hangzhou310004，Zhejiang，China)

Objective To investigate the expression of interleukin-37 in Helicobacter pylori(HP) positive patients with gastric adenocarcinoma. Methods 78 cases of patients with gastric adenocarcinoma recruited in our hospital from January 2014 to December 2015 were selected. Among them, seventy-eight inpatients with gastric adenocarcinoma [HP(+) 46 cases, HP(-) 32 cases], and 30 outpatients with HP(+) gastric ulcer, and 30 outpatients with HP(-) were studied. The plasma IL-37 levels of each group were determined by ELISA. Western blot was used to test IL-37 protein in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma. And RT-PCR was used to test IL-37 mRNA in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma tissue. Results ① Expression of plasma IL-37 protein in each group: there were no statistically significant difference between HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P>0.01). It was increased signifcantly in the HP(+) ulcer group compared with HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01), and it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with other groups (P<0.01). ② Expression of IL-37 protien in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). ③ Expression of IL-37 mRNA level in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). Conclusion The plasma IL-37 level was increased when patients were infected by HP, and the expression of IL-37 protein and mRNA were increased significantly in gastric adenocarcinoma tissue of HP (+) patient with gastric adenocarcinoma. IL-37 might involved in the occurrence and development of gastric adenocarcinoma in patients with HP.

Helicobacter pylori; Gastric adenocarcinoma; Interleukin-37

310004杭州，解放軍第117醫(yī)院普外科

方曉明，E-mail：FXM117@163.com

龔謀春，方曉明，姚 寧,等.幽門螺桿菌相關(guān)性胃腺癌中IL-37的表達(dá)及意義[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(2):153-156.

R735.2

A

1672-271X(2017)02-0153-04

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.02.010

2016-08-28;

2017-02-18)