抗瘤丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馮英楠 陳菲 張鵬 莊偉 林曉蘭

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·論著·

抗瘤丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馮英楠 陳菲 張鵬 莊偉 林曉蘭

目的 建立抗瘤丸系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以提高其質(zhì)量。 方法 分別采用薄層色譜法對(duì)院內(nèi)制劑抗瘤丸中三七、土茯苓、沉香、制何首烏及顯微鑒別法對(duì)炒山楂進(jìn)行定性鑒別；并用高效液相色譜法對(duì)制劑中的三七、土茯苓進(jìn)行含量測(cè)定。 結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、落新婦苷分別在0.3331～5.3302 μg(r=0.9999)、0.7857～12.5709 μg(r=0.9999)、0.1478～2.3654 μg(r=1.0000)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.70%、99.08%、98.76%。 結(jié)論 該法靈敏、簡便、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，可作為抗瘤丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

抗瘤丸； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 高效液相色譜法； 薄層色譜法

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一類腫瘤，呈迅速的浸潤性生長，治療困難，且生存期短，死亡率高，對(duì)人類健康威脅極大。外科手術(shù)是目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要手段，但是由于腦膠質(zhì)瘤浸潤性生長的特性以及多累及腦重要功能區(qū)域或其附近，手術(shù)難以將腫瘤全部切除。放、化療雖可殺滅腫瘤細(xì)胞，但也將損傷正常腦組織，并導(dǎo)致全身不良反應(yīng)的發(fā)生。

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的醫(yī)院制劑，主要功效為利濕解毒、扶正培本、活血化瘀。用于膠質(zhì)瘤之濕熱藴毒證，臨床以頭痛、眩暈、視物不清，或兼嘔吐，舌紫黯或有瘀斑，脈沉或沉細(xì)等為特征，適用于腦膠質(zhì)瘤、腦垂體瘤等見上述表現(xiàn)者的輔助治療。自1980年應(yīng)用于臨床，至今已有30年的歷史，深受廣大患者的好評(píng)。于1986年獲北京科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，其有效率高達(dá)64.7%[1]；回顧性研究表明，院內(nèi)制劑中藥抗瘤丸可以延長惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間，具有肯定療效[2]。筆者對(duì)抗瘤丸進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，可有效地控制抗瘤丸質(zhì)量。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

三七皂苷R1(批號(hào)：110745-201318)；人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-201424)；人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201128)；落新婦苷對(duì)照品(批號(hào)：111798-201303)；三七(批號(hào)：120941-201409)；制何首烏(批號(hào)：121454-201405)；沉香(批號(hào)：121222-201203)；均由中國食品藥品檢定研究院提供?？沽鐾瑁?60201批， 160202批， 160203批；均由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院提供。

1.2 儀器

SHIMADZU LC-2010Aht高效液相色譜儀；WFH-203S三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；SHIMADZU UV-2450紫外可見分光光度計(jì)；LD5-2A低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；CPA225D精密電子天平(十萬分之一，Sartorius)；WT1003H電子分析天平(千分之一，常州市萬泰天平儀器有限公司)；澳浦UB203i顯微鏡(重慶重光實(shí)業(yè)有限公司)；硅膠G薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)：120712)；硅膠G(薄層層析用，青島海洋化工有限公司，批號(hào)：0101116)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 三七鑒別 取本品適量，研細(xì)，取約3 g，加甲醇30 mL，加熱回流30分鐘，蒸干濾過液，殘?jiān)尤胨?0 mL，攪拌至溶解，轉(zhuǎn)移到分液漏斗，放冷后，20 mL乙醚振搖提取2次，棄去乙醚液，水飽和的正丁醇提取水液2次，每次15 mL，合并正丁醇液，用15 mL水洗滌，蒸干正丁醇液，加甲醇1 mL溶解殘?jiān)?，作供試品溶液。另取三七?duì)照藥材0.5 g，加甲醇30 mL，同法制得對(duì)照藥材溶液。再取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、及三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇，制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺三七的陰性樣品3 g，按供試品溶液的方法制備成陰性對(duì)照溶液。吸取供試品、對(duì)照藥材溶液各1 μL、對(duì)照品溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇∶乙酸乙酯∶水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴灑10% 硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

2.1.2 何首烏鑒別 取本品適量，研細(xì)，取約10 g，加甲醇30 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加5%氫氧化鈉溶液8 mL溶解殘?jiān)?，過濾，加HCl調(diào)節(jié)pH值為2，用30 mL乙酸乙酯振搖提取，蒸干乙酸乙酯液，加乙酸乙酯1 mL溶解殘?jiān)?，離心，取上清作為供試品溶液。取制何首烏對(duì)照藥材0.5 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。取缺何首烏的陰性樣品10 g，按供試品溶液的方法制備成陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液5 μL、對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸 (15∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，置氨熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。見圖2。

2.1.3 土茯苓鑒別 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，置三角瓶中，加甲醇20 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加水5 mL溶解殘?jiān)?，通過大孔吸附樹脂柱，用水60 mL洗脫，棄去洗脫液，再用25%乙醇60 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用50%乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇2 mL溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取落新婦苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。取缺土茯苓的陰性樣品0.5 g，按供試品的方法制備成陰性對(duì)照溶液。吸取供試品3 μL、對(duì)照品2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(13∶32∶9)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5% 三氯化鋁乙醇溶液，放置5分鐘，紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖3。

2.1.4 沉香鑒別 取本品適量，研細(xì)，取約2 g，加石油醚(30～60℃)30 mL，超聲30分鐘，蒸干濾過液，加丙酮2 mL溶解殘?jiān)?，作供試品溶液。另取?duì)照藥材粉末0.2 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。取缺沉香的陰性樣品2 g，按供試品的方法制備成陰性對(duì)照溶液。吸取供試品、對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶乙醚(10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴10% 硫酸乙醇溶液，晾干，紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖4。

2.2 山楂顯微鑒別

取本品，研細(xì)，置顯微鏡下觀察：果皮石細(xì)胞淡紫紅色或黃棕色，類圓形，直徑約至120 μm。見圖5。

注：a．人參皂苷Rb1、Rg1與三七皂苷R1；b．抗瘤丸(批號(hào)160201)；c．抗瘤丸(批號(hào)160202)；d．抗瘤丸(批號(hào)160203)；e．三七陰性樣品注：a．何首烏陰樣品性；b．抗瘤丸(批號(hào)160201)；c．抗瘤丸(批號(hào)160202)；d．抗瘤丸(批號(hào)160203)；e．何首烏對(duì)照藥材注：a．土茯苓陰性樣品；b．土茯苓對(duì)照藥材；c．抗瘤丸(批號(hào)160201)；d．落新婦苷；e．抗瘤丸(批號(hào)160202)；f．抗瘤丸(批號(hào)160203)注：a．沉香對(duì)照藥材；b．抗瘤丸(批號(hào)160201)；c．抗瘤丸(批號(hào)160202)；d．抗瘤丸(批號(hào)160203)；e沉香陰性樣品圖1 三七薄層色譜鑒別圖2 何首烏薄層色譜鑒別圖3 土茯苓薄層色譜鑒別圖4 沉香薄層色譜鑒別

圖5 山楂顯微鑒別

2.3 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18(6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液；檢測(cè)波長為203 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含三七皂苷R10.1 mg、人參皂苷Rg10.5 mg的混合溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，水浴回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，補(bǔ)足減重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，先用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次30 mL，取正丁醇液揮干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 處方中除去三七，按比例稱取其他藥材及輔料同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 三七皂苷R1：精密量取上述對(duì)照品溶液0.5、1.0 、2.0 、4.0 、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成33.31、66.63、133.20、266.51、533.02 μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻，分別精密量取10 μL，注入色譜儀，測(cè)得峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=300837.5833X-2769.7782。三七皂苷R1在0.3331 μg～5.3302 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

人參皂苷Rg1：方法同“三七皂苷R1線性關(guān)系考察”，配制成78.57、157.14、314.27、628.54、1257.09 μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻，分別精密量取10.00 μL，注入色譜儀，測(cè)得峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y=245606.5070X+22209.2712，人參皂苷Rg1在0.7857 μg～12.5709 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按前文“色譜條件”項(xiàng)下的色譜柱條件測(cè)定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為1.60%、1.47%，表明樣品中間精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(20160201)1份，按前文“供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備和測(cè)定法操作，分別在制備后0、2、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣。在24小時(shí)內(nèi)測(cè)得三七皂苷R1平均峰面積為267778.8，RSD=0.68%；人參皂苷Rg1平均峰面積為1487077.8，RSD=0.58%。表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(20160201)連續(xù)進(jìn)樣6次，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果顯示：三七皂苷R1平均含量為0.887 mg/g， RSD=1.34%； 人參皂苷Rg1平均含量為5.961 mg/g，RSD=1.99%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量的三七皂苷R1人參皂苷Rg1，按前文“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在前文色譜條件測(cè)定計(jì)算回收率。結(jié)果見表1、表2。2.3.10 樣品含量測(cè)定 根據(jù)上述確定的三七含量測(cè)定方法，進(jìn)行了抗瘤丸成品含量測(cè)定，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測(cè)定三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含量。結(jié)果見表3。

表3 三批樣品三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含量測(cè)定

2.4 落新婦苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液(39∶61)；檢測(cè)波長為291 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 落新婦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL含落新婦苷40 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲30分鐘，放冷，再稱定重量，補(bǔ)足減重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.4.4 陰性對(duì)照溶液的制備 處方中除去土茯苓，按比例稱取其它藥材及輔料同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，分別用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成14.78、29.57、59.14、118.27、236.54 μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻，分別精密量取10 μL，注入色譜儀，測(cè)得峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=2278593.7544X-3132.1353。落新婦苷在0.1478 μg～2.3654 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 三七皂苷R1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 落新婦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按前文“供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液的制備和測(cè)定法操作，測(cè)定落新婦苷的RSD=0.58%。表明樣品重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(20160201)連續(xù)進(jìn)樣6次，按前文“供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備和測(cè)定法操作，分別在制備后0、2、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣。在24小時(shí)內(nèi)測(cè)得落新婦苷平均峰面積為933753.5，RSD=0.14%，表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(20160201)連續(xù)進(jìn)樣6次，按前文方法制備樣品溶液和測(cè)定法項(xiàng)下操作，測(cè)定落新婦苷的平均含量為1.324 mg/g，RSD=0.69%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.4.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取落新婦苷對(duì)照品11.30mg，按前文方法制備樣品溶液，在前文色譜條件測(cè)定計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

2.4.10 樣品含量測(cè)定 根據(jù)上述確定的土茯苓含量測(cè)定方法，進(jìn)行了抗瘤丸成品含量測(cè)定，按照前文中的描述配制方法配制供試品溶液，測(cè)定落新婦苷含量。結(jié)果見表5。

表5 三批樣品落新婦苷含量測(cè)定

3 討論

本研究對(duì)抗瘤丸中的君藥進(jìn)行定性、定量鑒別；對(duì)臣藥及貴重藥進(jìn)行定性鑒別，完善了抗瘤丸質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。三七薄層色譜鑒別中，以《中華人民共和國藥典》2015版[3]的展開劑三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(15∶40∶22∶10)展開，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)模糊，分離度不佳，故以正丁醇∶乙酸乙酯∶水(4∶1∶5)為上層溶液，斑點(diǎn)清晰，分離度好[4-5]。沉香薄層色譜鑒別中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。但供試品溶液比較黏稠，超過2 μL就很難點(diǎn)樣，且斑點(diǎn)不太圓整。經(jīng)文獻(xiàn)檢索[6]，噴以10%硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視，在Rf值0.5～0.7處有斑點(diǎn)顯色清晰，效果較直接檢視更好。人參皂苷Rb1總平均回收率僅為78.11%，且數(shù)據(jù)很難穩(wěn)定。經(jīng)文獻(xiàn)檢索[1]，人參皂苷Rb1在酸性和堿性條件下均不穩(wěn)定，其水溶液在加熱下也不穩(wěn)定。供試品在制備過程中，氨試液洗滌后，正丁醇液呈堿性，并加熱蒸干，可能會(huì)造成人參皂苷Rb1降解，但此為供試品制備必須步驟，無法略去， 故綜合考慮，放棄人參皂苷Rb1，僅將人參皂苷Rg1和三七皂苷R1列入正文。綜上所述，本文所建標(biāo)準(zhǔn)可用于抗瘤丸的質(zhì)量控制。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Quality standard forKangLiuWan

FENGYingnan,CHENFei,ZHANGPeng,etal.

DepartmentofPharmacyXuanwu，HospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China

LINXiaolan，E-mail：xllin83@163.com

Objective To establish the quality standards ofKangLiuWan(KLW), to improve its quality. Methods Thin layer chromatography(TLC) was used to qualitative identification of Notoginseng Radix et Rhizoma、Smilacis Glabrae Rhizoma、Aquilariae Lignum Resinatum、Polygoni Multiflori Radix Praeparata, and microscopic identification method was used to qualitative identification of Crataegi Fructus; HPLC was applied to quantitatively determining the contents of Notoginseng Radix et Rhizoma and Smilacis Glabrae Rhizoma.Results The TLC spots were clear and well-separated；Notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1,and Chinese astilbin showed good relationships within the ranges of 0.3331～5.3302 μg (r=0.9999)、0.7857～12.5709 μg (r=0.9999)、0.1478～2.3654 μg (r=1.0000)，the average recovery were 98.70%、99.08%、98.76%，respectively.Conclusion The method is simple，sensitive, accurate and reproducible，and can be used as the quality control standard ofKLW.

KLW； Quality standards； HPLC； TLC

北京市科委“十病十藥”專項(xiàng)(Z141100002214016)

100053 北京，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科

馮英楠(1988- )，女，碩士，藥師。研究方向：中藥藥效與作用機(jī)制研究。E-mail：fengyingnan88@163.com

林曉蘭(1963- )，女，本科，主任藥師。研究方向：中藥制劑研發(fā)與醫(yī)院藥學(xué)管理。E-mail：xllin83@163.com

R286

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.004

2017-02-16)