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    牛病毒性腹瀉病毒檢測方法研究進(jìn)展

    2022-03-01 02:39:01秦義嫻陳曉春薛青紅吳華偉高月異高金源
    關(guān)鍵詞:免疫吸附電鏡敏感性

    秦義嫻,劉 丹,陳曉春,薛青紅,吳華偉,高月異,高金源

    (中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

    牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以高熱、腹瀉、懷孕母牛流產(chǎn)或胎兒畸形、口腔和消化道黏膜糜爛、壞死及血小板和白細(xì)胞減少為主要特征的接觸性傳染病[1]。BVDV的自然宿主是牛,感染懷孕牛后,可導(dǎo)致持續(xù)性感染(persistent infection,PI)牛犢的出生,PI牛在整個(gè)生存周期持續(xù)排出大量感染性病毒顆粒,是易感動(dòng)物感染病毒的主要來源。目前BVD呈全球性分布,給各國的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,急性感染的病牛導(dǎo)致的損失達(dá)每頭牛46.5美元[2]。

    BVDV包括BVDV-1、BVDV-2兩種基因型,每種基因型都包括致細(xì)胞病變型(cytopathic,CP)和非致細(xì)胞病變型(non-cytopathic,NCP)兩種生物型。根據(jù)5’-UTR、Npro和E2基因序列的差異,將BVDV-1分為至少22個(gè)基因亞型,將BVDV-2分為4個(gè)基因亞型。BVDV在我國各個(gè)省份均有流行,且流行形勢(shì)較為復(fù)雜,新疆、云南等地部分牛場的BVDV陽性率達(dá)60%以上[3-4]。有些地區(qū)牛群中甚至同時(shí)流行多種亞型[5]。當(dāng)前,BVDV的防控主要依靠疫苗免疫及清除PI牛,而如何準(zhǔn)確對(duì)BVDV感染牛及PI牛進(jìn)行鑒別診斷顯得尤為重要。本文綜述了國內(nèi)外BVDV檢測方法的研究進(jìn)展,以期為BVD的防控和凈化提供參考。

    1 病原學(xué)診斷

    1.1 病毒的分離鑒定

    各種牛源細(xì)胞均可用于BVDV的分離培養(yǎng),目前最常用的是傳代牛腎(MDBK)細(xì)胞。將病毒分離材料,如牛血清樣本、分泌物、排泄物等經(jīng)過處理后接種MDBK細(xì)胞,如是致細(xì)胞病變型毒株,可在接種細(xì)胞后的最初幾代內(nèi)出現(xiàn)皺縮、變圓、拉網(wǎng)、脫落,聚集后產(chǎn)生合胞體和巨細(xì)胞等現(xiàn)象即可初步確定為BVDV。而非致細(xì)胞病變型毒株,則需盲傳3代~5代,最終結(jié)合免疫熒光等方法確定病毒分離成功。BVDV的分離鑒定是最基礎(chǔ)的檢測BVDV的技術(shù),是鑒別BVDV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”,該項(xiàng)技術(shù)不需要特殊的儀器設(shè)備,僅進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即可。但該方法操作周期較長,不能滿足BVDV快速檢測的需求,且不適用于大量樣本的檢測。此外,該項(xiàng)技術(shù)對(duì)細(xì)胞、血清的要求較高,特別是近些年作為細(xì)胞分離培養(yǎng)原材料之一的胎牛血清中BVDV污染較為嚴(yán)重,較大程度限制了該方法的使用。目前有研究人員使用異源血清進(jìn)行分離培養(yǎng)[6]。

    1.2 電鏡檢查

    電鏡檢查是觀察BVDV顆粒的經(jīng)典方法,常用的有直接電鏡技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。直接電鏡技術(shù)對(duì)BVDV樣本的量要求較高(約107個(gè)/mL),觀察到的BVDV顆粒通常是散在的,但可觀察到病毒粒子的自然形態(tài)。李禎等[6]在透射電鏡下觀察到直徑為40 nm~60nm的球形、外被囊膜的BVDV顆粒。而免疫電鏡技術(shù)通??梢姷酱罅康腂VDV顆粒聚集在一起。王冶才等[7]利用免疫電鏡技術(shù),觀察到大小不等的BVDV粒子。相較于直接電鏡技術(shù),免疫電鏡技術(shù)敏感性更好,且可更快速地觀察到病毒粒子。近些年又發(fā)展出檢測BVDV的蛋白A膠體金免疫電鏡技術(shù),相較于傳統(tǒng)的直接電鏡技術(shù)和免疫電鏡技術(shù),該技術(shù)敏感性更高,更快速。但不管是哪種電鏡技術(shù),均需專業(yè)人員使用專業(yè)的儀器設(shè)備進(jìn)行操作,檢測成本較高,且檢測時(shí)間較長,僅適用于初篩為BVDV陽性樣本的確認(rèn),該方法只能用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測,無法推廣到基層。

    2 血清學(xué)方法

    2.1 血清中和試驗(yàn)

    血清中和試驗(yàn)是對(duì)BVDV或抗體進(jìn)行定性或定量分析的一種方法,在實(shí)際操作中,可對(duì)疑似感染牛間隔3周~4周前后采血2次,測定血清的中和抗體效價(jià),如果第2次高于第1次4個(gè)滴度以上可判為陽性,2個(gè)滴度以上,視為疑似患病。該方法敏感性高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng),是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦的檢測BVDV抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法之一,廣泛用于BVDV的血清學(xué)調(diào)查。但在檢測抗體時(shí),因BVDV不同基因型及基因亞型的抗原性存在差異,抗原的選擇會(huì)對(duì)抗體滴度的精確定量存在影響[8],且由于持續(xù)性感染牛對(duì)病毒缺乏免疫應(yīng)答而不產(chǎn)生抗體,在進(jìn)行血清中和試驗(yàn)時(shí)會(huì)因?yàn)殛幮越Y(jié)果而造成誤判。此外,該方法操作較為繁瑣,周期長,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,目前僅用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測。

    2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

    目前檢測BVDV的常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、阻斷ELISA、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)、葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(PPA-ELISA)、單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(M-ELISA)及細(xì)胞內(nèi)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(In Cell-ELISA)等。

    2.2.1 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是檢測BVDV抗體的常用方法,可用于檢測樣品中BVDV總抗體的濃度。但采用全病毒作為包被抗原需對(duì)BVDV大量增殖后進(jìn)行濃縮和純化,難度較高。為彌補(bǔ)這一缺點(diǎn),可采用重組蛋白作為包被抗原,其中結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2及非結(jié)構(gòu)蛋白p80因免疫原性較強(qiáng),常作為包被抗原。陳瑞紅[9]將3種蛋白分別進(jìn)行原核表達(dá)并建立ELISA方法,通過比較,認(rèn)為重組蛋白E2作為包被抗原建立的間接ELISA方法更為特異。

    2.2.2 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 捕獲抗體和檢測抗體一般由不同種屬的動(dòng)物制備,如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇2個(gè)針對(duì)BVDV不同抗原決定簇的單克隆抗體。胡俊英等[10]制備了抗BVDV E2蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體,并以此建立了基于單克隆抗體捕獲BVDV抗原的雙抗體夾心ELISA方法,動(dòng)物感染病毒后可通過檢測其糞便排泄物的BVDV抗原作出早期診斷。丁金華[11]與周子恒[12]分別利用納米抗體和多克隆抗體建立基于抗BVDV納米抗體雙抗體夾心ELISA檢測方法,用于檢測BVDV,雖然方法在敏感性方面存在問題,檢測效果不理想,但將納米抗體引入ELISA方法的建立過程,仍為BVDV檢測方法的改進(jìn)提供了新思路。

    2.2.3 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)也稱競爭ELISA,當(dāng)待檢樣品無法提純或不能進(jìn)行稀釋時(shí),可用此法檢測BVDV特異性抗體。王新平等[13]建立了雙抗體夾心阻斷ELISA方法,并對(duì)長春地區(qū)293頭奶牛和262頭黃牛的血清樣品進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,黃牛抗體陽性率高達(dá)43.5%。但阻斷ELISA的缺點(diǎn)是操作較為繁瑣,用時(shí)較長。

    2.2.4 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種經(jīng)濟(jì)、快捷,可肉眼直接判定的ELISA方法,適合BVDV的臨床診斷及抗體監(jiān)測。Zhao Y L等[14]建立了檢測BVDV抗體的間接Dot-ELISA,與Idexx ELISA試劑盒相比,該方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性分別為96.7%、92.5%和95%。

    2.2.5 葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白代替酶標(biāo)二抗建立的ELISA方法,其優(yōu)點(diǎn)是可用于多種哺乳動(dòng)物抗體的檢測。柴順秀等[15]利用BVDV重組E2蛋白建立了檢測BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法,結(jié)果顯示與Idexx ELISA試劑盒的檢出率無顯著差異。

    2.2.6 單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及In Cell酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 單層酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將細(xì)胞培養(yǎng)與ELISA結(jié)合的檢測技術(shù)。研究人員通過比較發(fā)現(xiàn),檢測BVDV時(shí),M-ELISA與病毒分離試驗(yàn)敏感性無顯著性差異,但比免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)方法更快速,且更客觀。In Cell-ELISA是一種用于檢測和分析BVDV感染的新方法,將BVDV的傳染性標(biāo)準(zhǔn)化為培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量,可用于CP和NCP毒株的檢測[16]。ELISA方法是目前檢測BVDV應(yīng)用最廣泛的方法之一,與經(jīng)典的病毒分離等方法相比,該方法可同時(shí)對(duì)批量樣本進(jìn)行檢測,且對(duì)儀器設(shè)備和試驗(yàn)人員的要求較低。但利用ELISA方法進(jìn)行BVDV抗體檢測時(shí),容易受到母源抗體的干擾,且與同屬的豬瘟病毒(Classical swine fever viru,CSFV)之間存在交叉反應(yīng),也不能對(duì)PI牛進(jìn)行篩選。

    2.3 免疫熒光技術(shù)

    檢測BVDV常用的方法有直接免疫熒光技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)。直接免疫熒光技術(shù)即將熒光素標(biāo)記在抗體上,直接與BVDV抗原發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是簡便快捷,特異性高,非特異性染色少,缺點(diǎn)是敏感性低,且標(biāo)記的抗體需達(dá)到一定濃度,否則熒光太弱,影響結(jié)果的觀察。此外,有研究表明BVDV基因型及抗原差異對(duì)直接免疫熒光試驗(yàn)影響較大[17]。間接免疫熒光方法較直接免疫熒光方法敏感性提高,該方法與血清中和試驗(yàn)、病毒分離試驗(yàn)的結(jié)果高度相關(guān),且敏感性高于抗原捕獲ELISA,更適合用于血清中BVDV抗原的檢測[18-20],但其缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生非特異性熒光。不管是直接方法還是間接方法,都需要使用熒光顯微鏡,對(duì)儀器設(shè)備的要求較高,一般僅用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測,無法用于基層檢驗(yàn)。

    2.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

    瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度不高,與微量中和試驗(yàn)的陽性率之間差異極顯著(P<0.01)[21],且僅能檢測出BVDV群特異性抗體,與CSFV存在交叉反應(yīng)。不能用于BVD的精確診斷,盡管如此,因瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作簡便,無需特殊的設(shè)備或試劑,可用于大量血清樣本的檢測,常作為基層BVDV檢測的初篩方法。

    3 分子生物學(xué)方法

    3.1 核酸擴(kuò)增

    3.1.1 RT-PCR 目前已廣泛用于BVDV的鑒定、分型及遺傳進(jìn)化分析,對(duì)CP型和NCP型毒株均可檢測,該方法特異性高、敏感性強(qiáng)、檢測周期短,能批量檢測臨床樣本,且多次檢測時(shí)可篩選出群體中的持續(xù)性感染動(dòng)物[22],對(duì)于BVDV的防控具有重要意義。隨后,在普通PCR的基礎(chǔ)上,研究人員又建立了套式RT-PCR及可同時(shí)檢測BVDV與常見牛腹瀉疾病的雙重或多重RT-PCR方法,檢測靈敏度高于普通PCR[23],且大大提高了檢測效率,降低了檢測成本。但普通RT-PCR只能定性分析,需通過瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果,在操作過程中常因氣溶膠污染出現(xiàn)假陽性,且存在非特異性條帶時(shí)容易產(chǎn)生誤判。因此,在操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置陰陽性對(duì)照,保障結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然該方法應(yīng)用廣泛,但因需要PCR儀,尚無法推廣到基層進(jìn)行使用。

    3.1.2 熒光定量RT-PCR 在普通RT-PCR基礎(chǔ)上,研究人員建立了檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法,敏感性顯著高于RT-PCR[24],且能定量分析待檢樣品。加入反應(yīng)體系后不必打開反應(yīng)管,一定程度上避免了氣溶膠污染。但該方法需要熒光定量PCR儀,儀器的使用和維護(hù)成本較高,試劑和耗材也高于普通PCR儀,僅可用于BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測。

    3.1.3 RT-LAMP 近年來,隨著環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的發(fā)展,研究人員建立了可用于BVDV檢測的RT-LAMP檢測方法,該方法雖然與病毒分離方法的陽性率差異較大,但與Idexx抗原捕獲ELISA方法的陽性率無明顯差異[25],且從試驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜程度、擴(kuò)增反應(yīng)效率、使用儀器簡單程度及檢測成本等方面均優(yōu)于熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR[26],更適合用于基層BVDV的快速檢測。范晴等[27]在RT-LAMP的基礎(chǔ)上,在LAMP引物中標(biāo)記熒光基團(tuán),建立了二重?zé)晒釸T-LAMP,反應(yīng)后通過擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色讀取反應(yīng)結(jié)果,可準(zhǔn)確鑒別檢測BVDV和牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)兩種病毒,解決了國內(nèi)多重LAMP方法不能準(zhǔn)確檢測是哪種病原而引起陽性結(jié)果的問題。

    3.1.4 納米PCR 納米PCR是一種新型的PCR技術(shù),敏感性高于常規(guī)PCR,可用于BVDV的快速檢測。劉澤余等[28]利用該技術(shù)對(duì)吉林省部分省界地區(qū)的血清樣品及臨床組織病料進(jìn)行檢測,共檢測出150份陽性血清樣品,BVDV陽性率為19.21%。

    3.1.5 重組聚合酶擴(kuò)增-側(cè)向試紙條檢測 該技術(shù)簡稱為RPA-LFD。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinant polymerase amplification,RPA)被認(rèn)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù),侯佩莉等[29]針對(duì)BVDV 5’UTR序列,建立了一種BVDV RPA-LFD檢測方法,檢測限達(dá)2TCID50,與WOAH推薦的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測限一致。

    3.2 核酸探針雜交技術(shù)

    3.2.1 核酸探針雜交技術(shù) 廣泛應(yīng)用于病毒或細(xì)菌的基因檢測。根據(jù)標(biāo)記物的不同,一般將核酸探針分為兩類:一類是放射性同位素標(biāo)記探針(如32P等),一類是非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸探針(如生物素、地高辛等)。因放射性同位素具有放射危害且半衰期短、不穩(wěn)定,目前BVDV的檢測常用的是非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸探針。雜交試驗(yàn)可以檢測CP型和NCP型毒株,且敏感性比BVDV感染試驗(yàn)強(qiáng)10倍~100倍[30]。值得注意的是,針對(duì)BVDV基因組不同區(qū)域的探針,檢測率存在差異,針對(duì)5’末端的探針檢出率高于其他區(qū)域[31-32]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,Heidari Z等[33]建立了交聯(lián)與非交聯(lián)金納米雜交試驗(yàn),可直接檢測BVDV,無需擴(kuò)增,檢測靈敏度可達(dá)每反應(yīng)6.83 ng和44.36 ng,兩種方法成本低廉,操作簡單,可用于BVDV臨床樣本的檢測。核酸探針雜交技術(shù)操作簡便、特異性高、敏感性強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確,可在同一張膜上進(jìn)行幾個(gè)甚至上百個(gè)樣品的檢測,可用于BVDV大量樣本的快速檢測,但單個(gè)樣品的檢測成本較高。

    3.2.2 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是分子雜交技術(shù)的發(fā)展,與傳統(tǒng)的核酸分子雜交技術(shù)相比,該方法可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測,并能同時(shí)檢測多種病原,由于該方法的反應(yīng)體積小,大大降低了檢測成本,能用于BVDV大規(guī)模的檢測篩選。隨后,高峰等[34]將LAMP技術(shù)與微流控芯片技術(shù)有機(jī)結(jié)合,可同時(shí)檢測包括BVDV在內(nèi)的5種病原,為口岸檢疫探索出一種快速、高通量檢測動(dòng)物疫病的方法。而魏春霞等[35]建立了一種可視化基因芯片檢測方法,具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn),可在3 h內(nèi)完成同時(shí)對(duì)包括BVDV在內(nèi)的7種牛重要疫病病原的檢測,在牛群疫病診斷、凈化及流行病學(xué)調(diào)查等方面具有良好的應(yīng)用前景。

    4 結(jié)語

    BVDV是影響全球養(yǎng)牛業(yè)的主要?jiǎng)游镆卟〔≡?,在我國感染范圍廣泛,且具有遺傳多樣性。準(zhǔn)確鑒別檢測BVDV,以了解該病在我國的流行現(xiàn)狀及主要流行毒株,同時(shí)篩查并清除PI牛,為我國BVD的防控及凈化提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。目前,診斷BVD的方法很多,每種方法都有適用性,也有局限性,應(yīng)根據(jù)檢測目的的差異,選擇不同的方法,如牛場臨床樣本的初篩可選擇瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)及RT-PCR;出入境口岸可選擇基因芯片技術(shù)、多重?zé)晒舛縍T-PCR等高通量檢測方法,可快速檢測多種病原;對(duì)于可疑樣本可選擇病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光及電鏡檢查等方法進(jìn)行最終確定,并利用RT-PCR進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。實(shí)際工作中,往往選擇幾種檢測方法對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測,以避免假陽性或非特異性結(jié)果的出現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,相信會(huì)有越來越多更加敏感、特異、快速的檢測方法的建立,為BVDV的精準(zhǔn)防控奠定基礎(chǔ)。

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