人工軟骨支架中TGF-β1緩釋殼聚糖微球?qū)TDC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

常亞南，劉浩，馮成寶，何曉亮，周曉輝

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人工軟骨支架中TGF-β1緩釋殼聚糖微球?qū)TDC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

常亞南1，劉浩2，馮成寶1，何曉亮1，周曉輝1

1 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050000 2 河北科技大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，河北石家莊 050000

為了提高本課題組前期構(gòu)建的Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的人工三維軟骨支架對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，采用乳化交聯(lián)法以殼聚糖為原料，加入細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1，并通過真空冷凍干燥技術(shù)制備了包裹TGF-β1的殼聚糖微球。然后分別將其與空白殼聚糖微球整合進(jìn)軟骨支架中，并接種小鼠軟骨細(xì)胞ATDC-5，通過觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)來評(píng)價(jià)緩釋微球在人工軟骨支架中對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)是否具有促進(jìn)作用。結(jié)果顯示所制得的殼聚糖微球球體表面光滑，分散均勻，直徑在100 nm左右，吸水率良好可達(dá)983.73%±4.38%，抗酶解作用較強(qiáng)，第28天時(shí)降解率僅達(dá)到51.0%±1.8%。由TGF-β1累積釋放曲線可知TGF-β1在開始的24 h內(nèi)釋放最快，之后逐漸減慢，在120 h之后進(jìn)入平臺(tái)期，具有緩釋效果。MTT試驗(yàn)以及熒光染色試驗(yàn)充分表明，由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

組織工程，軟骨支架，殼聚糖微球，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，小鼠軟骨細(xì)胞

關(guān)節(jié)軟骨的損傷和病變是臨床骨科的常見疾病。由于軟骨組織自身修復(fù)能力有限，一旦發(fā)生損傷病變，必須進(jìn)行修復(fù)或置換，如何有效地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷始終是醫(yī)學(xué)界尚待解決的難題之一[1]。近年來快速發(fā)展的組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)治療提供了新思路和新方法，研究者們紛紛把目光聚集到構(gòu)建人工軟骨支架的研究中[2]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)是由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子亞族組成的大家族[3]。其中TGF-β1是一個(gè)多功能蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，比如細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的代謝并可以抑制軟骨形成過程中軟骨細(xì)胞的終末分化[4]。有關(guān)細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞的作用研究表明，單獨(dú)將細(xì)胞因子植入體內(nèi)并不能顯著地促進(jìn)骨的生成，這是因?yàn)榧?xì)胞因子易被體液稀釋、降解等，因此需要有合適的緩釋體系才能有效地發(fā)揮細(xì)胞因子的 作用[5–6]。

本課題組已經(jīng)初步構(gòu)建了Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的人工三維軟骨支架[7]。為了進(jìn)一步提高該支架的生物學(xué)性能，本研究利用生物相容性好、無細(xì)胞毒副作用的殼聚糖作為載體材料[8–10]來制備緩釋微球，用于包裹TGF-β1，然后將空白殼聚糖微球和包裹有TGF-β1的殼聚糖微球分別整合進(jìn)軟骨支架中，接種小鼠軟骨細(xì)胞ATDC-5，通過觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)來分析緩釋微球在人工軟骨支架中對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)是否具有促進(jìn)作用。旨在探索性能良好的人工軟骨支架，為將來臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TGF-β1 (Peprotech)，殼聚糖 (Solarbio)，溶菌酶 (北京科百奧生物科技有限公司)，ELISA試劑盒 (聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，DMEM : F12細(xì)胞培養(yǎng)基 (Gibco)，胎牛血清 (Hyclone)，谷氨酰胺 (Solarbio)，Hoechest 33342 (Sigma)， FITC (Sigma)，Span 80 (Solarbio)，胰蛋白酶(Solarbio)，DMSO (MP)；小鼠軟骨細(xì)胞ATDC-5，購自南京科佰生物科技有限公司。

真空冷凍干燥機(jī) (Gene)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，掃描電子顯微鏡 (Hitachi)，倒置熒光顯微鏡 (Olympus)。

1.2 殼聚糖緩釋微球的制備

將2.5 mL殼聚糖溶液和20 μL TGF-β1溶液加入到5% Tween80液體石蠟混合液中，磁力攪拌器高速攪拌2 h至溶液均一。然后緩慢滴加濃度為5%、pH 2.5的三聚磷酸鈉溶液6.25 mL，高速攪拌2 h至溶液成為均一的乳濁液。高速冷凍離心機(jī)4 ℃、12 000×g條件下離心15 min，小心棄掉上層溶液，所得微球沉淀用異丙醇洗2次，每次均使用高速冷凍離心機(jī)在4 ℃、12 000 ×條件下離心15 min，再用雙蒸水洗4次，每次均按上述條件離心，沉淀置于–20 ℃冷凍，最后使用真空冷凍干燥機(jī)凍干后置于–20 ℃保存。

1.3 殼聚糖緩釋微球參數(shù)測(cè)定

1.3.1 掃描電子顯微鏡觀察微球形貌

冷凍干燥后的微球粉末進(jìn)行上機(jī)噴金，然后進(jìn)行掃描電子顯微鏡檢測(cè)，加速電壓為3 kV。

1.3.2 吸水率測(cè)定

稱量20 mg左右殼聚糖微球分別置于4個(gè)EP管中，分別稱重。每管加入1 mL PBS溶液，將其置于培養(yǎng)箱中，37 ℃、130 r/min條件下振蕩，分別在0.5、1.0、1.5、2.0 h時(shí)間段取出，3 000 r/min離心后棄上清并棄去表面殘留的水分后再次稱重。試驗(yàn)前質(zhì)量記為1，試驗(yàn)后質(zhì)量記為2。按以下公式計(jì)算吸水率。

吸水率(%)=(2–1)/1×100%

式中，1為吸水前殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)；2為吸水后殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)。

1.3.3 降解率測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取20 mg殼聚糖微球，置于6個(gè)EP管中，分別稱重。加入含溶菌酶107U/L的磷酸緩沖液 (PBS) 溶液，于培養(yǎng)箱中37 ℃、130 r/min條件下氣浴振蕩，分別在1、3、7、14、21、28 d取出，10 000 r/min離心5 min，棄上清后用雙蒸水漂洗沉淀2遍，–20 ℃冷凍，然后一起冷凍干燥，分別稱重。試驗(yàn)前質(zhì)量記為m，試驗(yàn)后質(zhì)量記為4。按以下公式計(jì)算降解率。

降解率(%)=(3–4)/3×100%

式中，3為降解前殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)；m為降解后殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)。

1.3.4 TGF-β1累積釋放曲線測(cè)定

分別稱取10 mg TGF-β1殼聚糖微球于1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，37 ℃條件下135 r/min振蕩，分別于2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取出后，10 000 r/min離心5 min。取出150 μL樣品，–20 ℃保存?zhèn)溆茫⒀a(bǔ)加150 μL PBS溶液繼續(xù)試驗(yàn)。7 d后采用ELISA試劑盒 (Human TGF-β1 Sunny Elisa) 測(cè)定吸光值，記為1。同時(shí)另取10 mg TGF-β1殼聚糖微球溶于 2 mL 2%乙酸溶液中，制成待測(cè)樣本，測(cè)定吸光值，記為2，并計(jì)算10 mg微球中包裹的生長(zhǎng)因子總量。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

以釋放時(shí)間為橫坐標(biāo)，/為縱坐標(biāo)測(cè)定繪制累積釋放率曲線、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照下面公式分別計(jì)算包封率和載藥量。

載藥量=溶液中藥物含量/微球質(zhì)量

包封率(%)=載藥量×微球總量/總投藥量×100%

1.4 三維復(fù)合軟骨支架的制備

稱取TGF-β1殼聚糖微球1 mg，將其分散在100 μL的90%乙醇中，然后加入到已構(gòu)建的三維軟骨支架中，–80 ℃冷凍后利用真空冷凍干燥機(jī)凍干，–20 ℃保存?zhèn)溆?，以上為試?yàn)組，對(duì)照組將不含有TGF-β1的殼聚糖微球按照同樣的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞在三維復(fù)合軟骨支架上的培養(yǎng)

采用24孔板來培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組在孔中加入含有TGF-β1的三維復(fù)合軟骨支架，對(duì)照組中加入不含有TGF-β1的三維復(fù)合軟骨支架。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞ATDC-5，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×104/mL，按照2.5×104/孔的密度接種到放有三維復(fù)合軟骨支架的孔板中培養(yǎng)。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

小心棄去孔中的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加入200 μL不含血清的新鮮培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液20 μL，于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃培養(yǎng)4 h。然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm條件下測(cè)定吸光值。分別在3、5、7、14 d利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 熒光染色法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

小心棄去孔中的培養(yǎng)基，加入1 mL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架，棄去PBS溶液，再加入990 μL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL濃度為5 mg/mL的FITC溶液，小心混勻。置于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃染色15 min。FITC染色結(jié)束后，用濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2–3次，每次3–5 min。然后加入990 μL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL濃度為 1 mg/mL的Hoechst 33342溶液，小心混勻。置于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃染色20 min，染色結(jié)束后，使用濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2–3次，每次3–5 min。分別在第3、5、7、14天進(jìn)行染色試驗(yàn)，并用倒置熒光顯微鏡觀察支架中的細(xì)胞，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察微球形貌

通過真空冷凍干燥機(jī)凍干的殼聚糖微球?yàn)榈S色粉末狀，粒度極細(xì)。由圖1可以看出，所制備的微球外觀為球狀，球體表面光滑，分散較好，大小均勻，直徑在100 nm左右。

2.2 殼聚糖緩釋微球的吸水率

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，殼聚糖緩釋微球在0.5、1.0、1.5、2.0 h所對(duì)應(yīng)的吸水率分別為301.21%±2.35%、976.32%±9.41%、977.67%±7.51%、983.73%±4.38%。

圖1 殼聚糖微球掃描電子顯微鏡圖

可以看出，在0.5 h的時(shí)候殼聚糖微球的吸水率約為自身重量的3倍，在1.0 h時(shí)達(dá)到平衡，約為自身重量的9.8倍，吸水率較高，具有很好的吸水膨脹性能，能夠增強(qiáng)殼聚糖微球的緩釋效果。

2.3 殼聚糖緩釋微球的降解率

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，殼聚糖緩釋微球在1、3、7、14、21、28 d的降解率分別為4.5%±0.6%、7.0%±0.8%、11.0%±1.6%、19.5%±1.6%、32.0%±1.5%、51.0%± 1.8%，如圖2所示。隨著溶菌酶對(duì)殼聚糖微球作用時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖微球逐漸被降解，并且降解速率在增加，降解速率的變化可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖微球的表面逐漸被酶解，逐漸破壞其乳化交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸暴露，溶菌酶對(duì)殼聚糖的降解作用更容易發(fā)揮。但第28天時(shí)降解率僅達(dá)到51.0%±1.8%，表明所制得的殼聚糖微球就有較強(qiáng)的抗酶解能力。

2.4 TGF-β1累積釋放曲線、包封率和載藥量

對(duì)包裹有TGF-β1殼聚糖微球緩慢釋放TGF-β1體系連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d，利用ELISA試劑盒檢測(cè)并繪制體外累積釋放曲線，如圖3所示，在最初的24 h內(nèi)TGF-β1的釋放率最大，24–120 h釋放量還在增加，但速率較最初的24 h減慢，在120 h之后，曲線平緩，表明釋放進(jìn)入平臺(tái)期，保持穩(wěn)定。7 d的累積釋放率為57.57%±1.32%。結(jié)合累積釋放曲線通過公式計(jì)算得殼聚糖微球載藥量為 (25.6±0.23) μg/g，包封率為80.21%±0.02%。

2.5 MTT法檢測(cè)ATDC-5細(xì)胞活力

對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞定期利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如圖4所示。整體來看，試驗(yàn)組細(xì)胞的活力均高于對(duì)照組細(xì)胞的活力。第3天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的細(xì)胞活力相差較小，這是因?yàn)閯傞_始培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞數(shù)目均相對(duì)較少，且吸收TGF-β1后有一個(gè)短暫的適應(yīng)期，在第3天開始表現(xiàn)出差異。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞緊貼三維復(fù)合軟骨支架生長(zhǎng)，數(shù)目逐漸增加，且TGF-β1的釋放量趨于穩(wěn)定，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞活力的差異逐漸表現(xiàn)出來，并且越來越顯著，在細(xì)胞培養(yǎng)2周時(shí)，差異極其顯著(<0.01)。以上結(jié)果充分說明，由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.6 熒光染色法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞定期進(jìn)行熒光染色后利用倒置熒光顯微鏡拍照，如圖5所示，其量化結(jié)果見表1。支架通過熒光照射呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞通過熒光照射呈現(xiàn)藍(lán)色，可以清楚看出支架為三維立體狀，細(xì)胞均勻吸附在三維立體支架中，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。圖5中分別記錄了培養(yǎng)3、5、7、14 d細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。接種細(xì)胞后3 d時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞均較少，這是因?yàn)閯傞_始培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞數(shù)目均相對(duì)較少且需經(jīng)過一個(gè)短暫的適應(yīng)期，并且在試驗(yàn)初期TGF-β1的釋放量較小。但是可以看出試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目多于對(duì)照組，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率增加，細(xì)胞在三維支架中均勻分散，且由于TGF-β1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目多，差異隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)越來越明顯。在培養(yǎng)14 d時(shí)，支架中細(xì)胞數(shù)目更多，細(xì)胞均勻分散在支架中，密度很大，且試驗(yàn)組尤其明顯。充分說明由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖5 支架上培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞ATDC-5熒光染色圖 (×400)

表1 ATDC-5熒光染色細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損修復(fù)的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)術(shù)[11]、軟骨細(xì)胞移植[12]、組織工程化軟骨[13–15]和凝膠類關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料[16–18]。其中，組織工程化關(guān)節(jié)軟骨被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料。因此，組織工程化軟骨中新型支架材料的開發(fā)成為一個(gè)熱點(diǎn)研究方向。應(yīng)用在組織工程的支架材料主要有膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖和羥基磷灰石等。許多學(xué)者紛紛致力于新型軟骨支架的開發(fā)研究[19–23]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的三維人工軟骨支架，孔徑為 (83.33±7.20) μm，孔隙率為86.63%±0.67%。研究人員普遍認(rèn)為組織工程軟骨支架的孔徑應(yīng)為 (60–200) μm，孔隙率應(yīng)在70%–90%[24–26]。因此，自制軟骨支架符合上述條件，有利于支架內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，對(duì)于支架內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝以及軟骨修復(fù)都有著重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過制備包裹生長(zhǎng)因子TGF-β1具有緩釋作用的殼聚糖微球，并將其整合到軟骨支架上用以培養(yǎng)小鼠軟骨細(xì)胞ATDC-5。MTT試驗(yàn)以及熒光染色試驗(yàn)結(jié)果充分證明該三維軟骨支架適合ATDC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著高于對(duì)照組，且在三維支架中分散均勻，培養(yǎng)14 d時(shí)，細(xì)胞密度增殖最大，較對(duì)照組高出近3倍。這為將來人工軟骨支架更好地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了參考依據(jù)。至于該自制人工軟骨支架在動(dòng)物體內(nèi)的生物相容性及慢性毒性等評(píng)價(jià)待進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

ATDC-5 growth promoted by sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 in artificial cartilage scaffolds

Ya’nan Chang1, Hao Liu2, Chengbao Feng1, Xiaoliang He1, and Xiaohui Zhou1

1,,050000,,2,,050000,,

In order to promote the growth of chondrocyte ATDC-5 in collagen type II-hyaluronic acid-chondroitin sulfate composite scaffolds constructed previously, the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 were prepared by emulsification and cross-linking. In addition, ATDC-5 was inoculated into the scaffolds incorporating the chitosan microspheres with TGF-β1. Results show that the morphology of microsphere was round and uniform, mean diameter was about 100 nm, absorption rate was up to 983.7%±4.38%.When the microsphere was incubated under the condition of 107U/L lysozyme, the degradation rate was only 51.0%±1.8% on day 28. Moreover, to compare the effect of TGF-β1, the growth of ATDC-5 in different scaffolds was observed by MTT assay and fluorescence staining test. According to the cumulative release curve, TGF-β1 was released quickly at initial 24 h, then gradually decelerated, finally reached the plateau after 120 h. MTT assay and fluorescence staining test demonstrated that the scaffolds were suitable for ATDC-5 growth and proliferation, as well as, suggested that the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 could significantly promote the growth of ATDC-5.

tissue engineering, cartilage scaffolds, chitosan microsphere, transforming growth factor, mouse chondrocyte

Supported by:"100 Talent Program" of Hebei Province (No. E2012100005), Scientific Research Staring Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education of China, Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2012208019).

河北省“百人計(jì)劃”項(xiàng)目(No. E2012100005)，教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金，河北省自然科學(xué)基金 (No. C2012208019) 資助。

September 26, 2016; Accepted: January 17, 2017

Xiaohui Zhou. Tel/Fax: +86-311-81668487; E-mail: zhouxh2003@aliyun.com