樹鼩角膜原代上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化與鑒定

苗雨潤, 宋慶凱, 匡德宣, 陳玲霞, 尹博文, 李曉飛, 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650118)

樹鼩角膜原代上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化與鑒定

苗雨潤, 宋慶凱, 匡德宣, 陳玲霞, 尹博文, 李曉飛, 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650118)

目的 建立樹鼩角膜上皮細(xì)胞(CECs)穩(wěn)定的體外培養(yǎng)技術(shù)，為人類角膜疾病研究提供新的實(shí)驗(yàn)材料。方法 使用改進(jìn)的雙酶消化法取得樹鼩CECs, 用轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)抑制劑配合梯度消化對(duì)樹鼩CECs進(jìn)行純化，角蛋白3/12抗體對(duì)CECs進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)及鑒定。結(jié)果 優(yōu)化的酶消化法可以快速、有效得到高純度的樹鼩CECs。TGF-β 抑制劑及梯度消化法可以達(dá)到良好的純化目的，純化的CECs在傳代過程中仍保持良好形態(tài)。樹鼩CECs免疫熒光染色顯示角蛋白3/12單克隆抗體陽性。結(jié)論 成功建立了一種有效、簡單、經(jīng)濟(jì)適用的樹鼩角膜上皮原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)，所獲得的原代細(xì)胞具有較好的上皮細(xì)胞形態(tài)特征并可以連續(xù)傳代，為眼科疾病的研究提供一種新材料。

樹鼩; 角膜上皮細(xì)胞(CECs); 原代培養(yǎng); 優(yōu)化; 鑒定

角膜細(xì)胞的成功培養(yǎng)是近年來角膜病研究與治療的基礎(chǔ)，隨著研究進(jìn)展的日漸深入，對(duì)角膜細(xì)胞的培養(yǎng)提出了更高要求。近年來，隨著細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展, 體外構(gòu)建生物工程角膜進(jìn)行移植成為治療角膜病新趨勢(shì)，其中高質(zhì)量的角膜上皮種子細(xì)胞是構(gòu)建生物工程角膜并成功移植的重要影響因素[1]。但由于人類角膜供體的極其短缺，限制了實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展，因此，尋找一種合適的、可以代替人類角膜上皮細(xì)胞(CECs)迫在眉睫。目前，成功的原代CECs培養(yǎng)模型已經(jīng)從人、兔、鼠、牛和豬[2-6]以及猴制備而得。但是，由于這些動(dòng)物與人類的種屬差異性過大或角膜的結(jié)構(gòu)和形態(tài)與人類角膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)差異極大，從而無法應(yīng)用于人類角膜疾病病理及藥理的研究。獼猴的角膜結(jié)構(gòu)及角膜細(xì)胞形態(tài)與人高度相似，被認(rèn)為可以用于人類角膜疾病研究[7]，但由于獼猴的應(yīng)用成本過高且存在一定的倫理學(xué)爭議，一直以來未能廣泛應(yīng)用于角膜疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建。近年來，樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因其分類地位上相比小鼠和大鼠要更接近于人，加之易于飼養(yǎng)與分布廣泛的特點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種人類疾病模型的研究，具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力[8]。近年有學(xué)者[9]研究表明，樹鼩角膜細(xì)胞的形態(tài)與發(fā)育過程都與人類的角膜細(xì)胞具有高度的相似性，其角膜的組織學(xué)特點(diǎn)、相關(guān)參數(shù)以及與人類的相似度引起了研究人員高度關(guān)注，被認(rèn)為是一種可用于研究人類角膜疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。雖然CECs的培養(yǎng)在國內(nèi)外已有不少報(bào)道，且培養(yǎng)技術(shù)一直不斷改進(jìn)[10-12]，但目前仍沒有任何關(guān)于樹鼩CECs體外培養(yǎng)的報(bào)道。以往報(bào)道的關(guān)于角膜細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)一直存在方法復(fù)雜和培養(yǎng)條件昂貴，對(duì)細(xì)胞損傷較大導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，以及雜質(zhì)成纖維細(xì)胞難以被去除等問題，導(dǎo)致得到CECs純度不高、難以傳代、細(xì)胞形態(tài)易發(fā)生改變，這嚴(yán)重制約了體外培養(yǎng)的角膜細(xì)胞的應(yīng)用范圍。此外，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，已報(bào)道的方法也并不適用于樹鼩的CECs培養(yǎng)，因此，尋求一種有效、簡單、經(jīng)濟(jì)的方法來建立樹鼩CECs，對(duì)眼表疾病、角膜病的基礎(chǔ)研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)使用的滇緬樹鼩是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供的1月齡樹鼩4只(雌雄不限)[SCXK(滇)K2013-0001]，[SYXK (滇)K2013-0001）]。

1.2 主要試劑及儀器

Ham’s F12細(xì)胞培養(yǎng)液、M199細(xì)胞培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素均購自美國HyClone公司; 胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液均購自以色列BI公司; 抗壞血酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司; ITS(Insulin-Transferrin-Selenium Solution)購自美國Gibco公司; 選擇性ALK5抑制劑(SB431542)購自美國Selleck公司; 表皮細(xì)胞生長因子(EGF)購自美國PeproTech公司, 小鼠角蛋白3/12 (CK3/12)單克隆抗體(ab68260)購自英國Abcam公司;熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG(H+L)購自美國Merck公司;硫酸軟骨素購自山東西亞試劑公司, 顯微操作儀(CDSD230)、倒置顯微鏡(ECLIPSE)均購自日本Nikon公司; CO2孵育箱(CO2T/C)購自美國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樹鼩原代CECs的取材 取1月齡樹鼩，注射1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉溶液致死，將其完整角膜取下后剪碎，加入3 mL消化液(膠原酶75 μg/mL, 中性蛋白酶20 μg/mL, DTT 0.5 mg/mL, 體積分?jǐn)?shù)1% FBS，DMEM 低糖)，置于37 ℃搖床上消化2 h后1 500 r/min離心10 min，用培養(yǎng)液沖洗3次后重懸細(xì)胞，吹打混勻后移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 使用Ham’s F12/M199以1∶1配制的培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細(xì)胞，在上述培養(yǎng)基內(nèi)添加體積分?jǐn)?shù)5%FBS，5 μg/mL抗壞血酸鈉溶液, 5 μg/L胰島素, 體積分?jǐn)?shù)1% ITS, 5 ng/mL EGF，100 U/m L 青霉素和100 μg/mL鏈霉素，5 ng/mL EGF。在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液。

1.3.3 樹鼩CECs的純化 在原代細(xì)胞生長融合至50%, 在培養(yǎng)液內(nèi)添加轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)抑制劑(10 μmol/L)抑制雜質(zhì)成纖維細(xì)胞生長, 每隔3 d觀察一次純化效果。

聯(lián)合使用梯度消化法去除雜質(zhì)成纖維細(xì)胞，即使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2 min，電子顯微鏡下觀察到大部分成纖維細(xì)胞變圓、懸浮后用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打后棄掉消化下來的細(xì)胞，PBS沖洗3次后添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 樹鼩CECs的鑒定 角蛋白3/12(CK3/12)免疫熒光染色鑒定純化的、傳至P3代的CECs，待其生長至80%融合后，PBS清洗2次，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次(每次2 min)，0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次，山羊血清封閉液封閉30 min，PBS漂洗3次, 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%BSA稀釋的小鼠角蛋白3/12單克隆一抗(1∶200)，4 ℃過夜，PBS漂洗三次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% BSA稀釋的熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶200), 37 ℃孵育1 h，PBS漂洗三次，抗淬滅封片劑封片, 在熒光顯微鏡下觀察。對(duì)成纖維細(xì)胞用相同方法進(jìn)行免疫熒光染色, 作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩CECs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)得到的樹鼩CECs長勢(shì)良好，12～18 h后見多數(shù)細(xì)胞貼壁，形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，以卵圓形、長梭形為主。3 d后見細(xì)胞呈乳頭狀向周圍漩渦狀散開，局部密度明顯增高，呈扁平單層多邊形形態(tài)，少部分外圍細(xì)胞呈長梭形, 具有偽足。6～7 d后，大部分細(xì)胞融合為一個(gè)圓形細(xì)胞群落，細(xì)胞形態(tài)以多邊形、單層為主，少部分細(xì)胞呈長梭形放射狀生長，表明有基質(zhì)細(xì)胞參雜其中。12 d左右細(xì)胞基本達(dá)到融合狀態(tài)，形態(tài)呈扁平單層不規(guī)則多邊形，部分細(xì)胞體積增大。此時(shí)可進(jìn)行傳代，經(jīng)純化的細(xì)胞傳代過程中仍可維持良好形態(tài)(圖1)。

2.2 樹鼩CECs的鑒定

角蛋白3/12免疫熒光染色結(jié)果呈陽性，符合樹鼩CECs的一般特征，對(duì)照組成纖維細(xì)胞呈陰性結(jié)果。使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染以初步鑒定上皮細(xì)胞的純度，結(jié)果顯示純度高達(dá)95%以上(圖2)。

圖 1 樹鼩CECs形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 The morphology of corneal epithelial cell from tree shrew in culture

圖 2 樹鼩CECs的免疫熒光鑒定(100×)Figure 2 Immunofluorescence of corneal epithelial cells from tree shrew (100×)

3 討論

自1950年代細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)興起以來，關(guān)于角膜細(xì)胞的培養(yǎng)在國內(nèi)外已有不少報(bào)道，雖然相關(guān)培養(yǎng)技術(shù)一直在不斷改進(jìn)，且眼表疾病的臨床前與臨床研究日益增多，但可以應(yīng)用于人類角膜疾病研究的角膜細(xì)胞模型的建立一直難以實(shí)現(xiàn)[13]。近年來，樹鼩作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被廣泛應(yīng)用于人類疾病動(dòng)物模型的建立。目前研究[9]已表明樹鼩的角膜與人類的角膜無論從結(jié)構(gòu)還是細(xì)胞形態(tài)上都高度類似，但并沒有針對(duì)樹鼩角膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。

目前, 原代CECs培養(yǎng)模型已經(jīng)成功從人、兔、鼠、牛和豬[14]以及猴制備而得。Kawazu等[15]最先開發(fā)了一種兔原代CECs培養(yǎng)模型，主要用于研究藥物的滲透和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。此細(xì)胞模型雖然具有與完整的兔角膜類似的復(fù)層結(jié)構(gòu)和橋粒，但是該模型的細(xì)胞跨膜電阻值(trans epithelial electrical resistance)只有150 Ψ/cm2，而且14C甘露醇的滲透性為離體兔角膜的100倍[16]，說明細(xì)胞間緊密性連接較差,不能合理表征其屏障功能,故應(yīng)用受到限制。而類似及更嚴(yán)重情況同樣出現(xiàn)在鼠、牛等動(dòng)物的CECs培養(yǎng)模型中，這表明這些動(dòng)物可能很難被應(yīng)用于人類角膜疾病病理方面的研究[17]。除此之外, 兔角膜面積是人角膜的2倍, 且眨眼頻率不同，兔5次/h的低眨眼頻率較人6～7次/min相比，減少了角膜前的藥物溶液的流失[18]，而其他動(dòng)物諸如牛、豬等又與人存在極大的種屬差異而不能應(yīng)用于藥理方面的研究。合適的人類角膜疾病動(dòng)物模型及細(xì)胞模型的缺乏，一直以來極大地限制了應(yīng)用于人類角膜疾病病理及藥理研究的發(fā)展。不同于以往的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，樹鼩的眨眼頻率在1～3次/5 min，這一點(diǎn)在相對(duì)于兔等動(dòng)物方面與人類具有高度相似性。此外，有學(xué)者[19]用電子顯微鏡觀察了樹鼩角膜的超微結(jié)構(gòu)，顯示樹鼩的角膜厚度雖然只有人類角膜的一半，但角膜結(jié)構(gòu)與人類非常相似，從前向后也分為角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和角膜內(nèi)皮層，而絕大部分動(dòng)物并不具有這樣的結(jié)構(gòu)，且樹鼩角膜各層結(jié)構(gòu)占角膜厚度的比例也跟人類的極為相似。也有學(xué)者[20]在比較了7種動(dòng)物的角膜組織結(jié)構(gòu)后認(rèn)為兔是7種動(dòng)物中最接近于人角膜結(jié)構(gòu)的動(dòng)物，可即便是最接近的，其與人角膜結(jié)構(gòu)及形態(tài)的差異也相去甚遠(yuǎn)。吳敏等[21]研究表明，獼猴與樹鼩由于在角膜上的各項(xiàng)參數(shù)與細(xì)胞形態(tài)上與人類的角膜高度相近，故認(rèn)為獼猴與樹鼩都可以作為研究人類角膜疾病合適的動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)所取得的樹鼩CECs無論從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小還是單位面積的細(xì)胞數(shù)量上與活體內(nèi)的樹鼩CECs相比較都高度相似，初步認(rèn)為具有樹鼩活體CECs的一般特征，可以應(yīng)用于人類角膜疾病的藥理研究。

以往的CECs取材方法總結(jié)包括3種：組織塊貼壁法[22]、消化法[23]與混合法[24]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建立了一套適用于樹鼩CECs的新的體外培養(yǎng)技術(shù)，本試驗(yàn)所采用的消化法沒有選用對(duì)細(xì)胞損傷較大的胰酶，而是采用了對(duì)細(xì)胞損傷較小的膠原酶和中性蛋白酶，通過成分與配比的優(yōu)化以達(dá)到消化目的，并且由于操作相對(duì)簡單、體系更為封閉，從而大大降低了細(xì)胞被污染的幾率。此外，以往使用傳統(tǒng)消化法獲得的CECs難以維持上皮細(xì)胞形態(tài)，并且由于胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞傷害較大而影響傳代數(shù)。本方法取得的樹鼩CECs在后續(xù)的傳代過程中沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞衰老現(xiàn)象并保持了良好的上皮細(xì)胞形態(tài)，至少可以傳至P18代細(xì)胞，鏡下觀察未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞活力降低現(xiàn)象。以往的CECs體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的難以持續(xù)，很大程度上是由于雜質(zhì)成纖維細(xì)胞的難以被去除。Okimaru等[25]研究表明，使用TGF-β抑制劑(SB431542)可以抑制人成纖維細(xì)胞的生長，本試驗(yàn)嘗試使用了TGF-β抑制劑(SB431542)以期達(dá)到純化目的，結(jié)果表明這種TGF-β抑制劑對(duì)樹鼩成纖維細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用。此外，為實(shí)現(xiàn)更高程度的純化目的，本實(shí)驗(yàn)在使用TGF-β抑制劑的基礎(chǔ)上聯(lián)合梯度消化法，可以將純化效率達(dá)到95%以上。

樹鼩CECs的培養(yǎng)及細(xì)胞系模型的建立為研究人類角膜病及眼表疾病提供了有效的研究手段。但本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳叭狈?duì)體外原代培養(yǎng)細(xì)胞與活體細(xì)胞間系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及電生理學(xué)方面數(shù)據(jù)比較，不能明確兩者間差異，故仍需不斷完善。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在傳代過程中，傳代超出P20代后細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞間隙也逐漸變大，當(dāng)傳至P25代以后細(xì)胞活力會(huì)逐漸下降，這可能與培養(yǎng)液中缺乏一些相關(guān)的細(xì)胞生長因子及彈力層細(xì)胞分泌的一些調(diào)節(jié)性旁分泌因子有關(guān)系，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將圍繞共培養(yǎng)及細(xì)胞信號(hào)通路等方面來探索著一種情況發(fā)生的可能性，使細(xì)胞更接近于活體CECs的生理或病理狀態(tài)，從而可以更真實(shí)、全面、良好的反映角膜病及眼表疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、藥物防治的情況，此外也可作為樹鼩CECs永生化的研究提供細(xì)胞源?？偠灾?，本研究通過長時(shí)間試驗(yàn)及多種方法的比較的證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)方法所取得的CECs經(jīng)免疫學(xué)鑒定是實(shí)驗(yàn)預(yù)期需要的種子細(xì)胞，不僅分離培養(yǎng)的條件相對(duì)容易，而且可以長期維持良好的CECs形態(tài)學(xué)特征并可以連續(xù)傳代，是可靠的、可用的樹鼩CECs。

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Primary Isolation, Culture, Purification and Identification of Corneal Epithelial Cells in Tree Shrew

MIAO Yu-run, SONG Qing-kai, KUANG De-xuan, CHEN Ling-xia, YIN Bo-wen, LI Xiao-fei, DAI Jie-jie
(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

Objectives To establish a stable technique for primary isolation, culture and purification and identification of tree shrew (Tupaia belangeri) corneal epithelial cells, and to provide a new experimental material for reserch of human ophthalmic corneal diseases.MethodsThe primary corneal epithelial cells from tree shrew were obtained by improved double digests method, the cells were purifed by method of cornea peeled off with transforming growth factor(TGF)-β inhibitors, achieve the purpose of identification by the method of immunofluorescence with keratin 3/12 antibody.ResultsThe primary corneal epithelial cells from tree shrew with high activity and purity were obtained by double digests method. The corneal epithelial cells were purified food by TGF-β inhibitors and gradient digestion, and the purified cells was maintained a good epithelial cells shape in the subculture. The result of tree shrew corneal epithelial cells by immunofluorescence staining with keratin 3/12 monoclonal antibodies were shown positive.ConclusionAn efficiency, simple and economic method was estabilshed for in vitro tree shrew corneal epithelial cells. The primary corneal epithelial cells from tree shrew with high activity and purity were obtained by double digests method, the subcultured cells was maintained a good epithelial cells shape. It will supply a new materials for eye diseases research .

Tree shrew (Tupaia belangeri); Corneal endothelial cells; In vitro; Primary culture; Optimization

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0130-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.009

2016-08-01

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2014BAI01B00), 云南省聯(lián)合支持國家計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA009)

苗雨潤(1993-), 男, 碩士, 研究方向: 人類疾病動(dòng)物模型。 E-mail: miaomiao415@vip.qq.com

代解杰(1961-), 研究員。E-mail: djj@imbcams.com.cn