自體DC/CIK細(xì)胞免疫治療對EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的影響

陸華東 馬志紅 劉志聰 邱國琴 華鋒 崔恩海 王斌

●論 著

自體DC/CIK細(xì)胞免疫治療對EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的影響

陸華東 馬志紅 劉志聰 邱國琴 華鋒 崔恩海 王斌

目的 探討自體DC/CIK細(xì)胞免疫治療對表皮生長因子受體（EGFR）基因突變陰性的晚期肺腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的影響。方法 選擇EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者120例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對照組各60例。治療組進(jìn)行DC/CIK細(xì)胞免疫治療，對照組僅進(jìn)行定期隨訪。采用RT-PCR法檢測兩組治療前、治療1個月和治療3個月的外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)（CEA mRNA、MK mRNA和Lunx mRNA），同時(shí)觀察兩組患者的腫瘤無進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）。 結(jié)果 治療組治療1個月和3個月后3種指標(biāo)的表達(dá)量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。同時(shí)兩組在治療1個月和3個月后3種指標(biāo)的表達(dá)量均較治療前明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。此外，治療3個月后，對照組有38例患者CEA mRNA達(dá)到了108copies/ml以上，有32例患者M(jìn)K mRNA達(dá)到了109copies/ml以上，有35例患者Lunx mRNA達(dá)到了109copies/ml。治療組和對照組腫瘤的中位PFS分別是3.10和2.52個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 自體DC/CIK細(xì)胞免疫治療在EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者的維持治療中達(dá)到了初步的療效，一定程度上延長了生存時(shí)間。

肺腺癌 DC/CIK 微轉(zhuǎn)移指標(biāo) 癌胚抗原mRNA 中期因子mRNA 肺癌特異性X蛋白mRNA 維持治療

近年來肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，已成為惡性腫瘤死亡的首要原因[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的80%[2-3]，NSCLC主要包括肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌相對于其他類型發(fā)病率較高[4]。肺癌傳統(tǒng)的治療模式有外科手術(shù)治療、放化療及這些治療方式的結(jié)合。目前，細(xì)胞治療藥物和靶向藥物在對完成4～6周期的一線含鉑方案治療后且疾病達(dá)穩(wěn)定或以上（部分緩解、完全緩解）的肺腺癌患者進(jìn)行后續(xù)的維持治療中已經(jīng)取得了不錯的療效[5]。但是在臨床工作中，一方面大多數(shù)患者很難耐受這些治療后引起的毒性反應(yīng)；另一方面對于表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）基因突變陰性的晚期肺腺癌患者，這些治療方案并不能取得相應(yīng)的療效[6-7]。因此，本研究采用樹突狀細(xì)胞（dendritic,DC）/細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cell,CIK）細(xì)胞免疫治療對一線化療達(dá)穩(wěn)定以上的EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者進(jìn)行維持治療，觀察患者腫瘤的無進(jìn)展生存時(shí)間（progression free survival,PFS），同時(shí)監(jiān)測治療前后外周血中微轉(zhuǎn)移指標(biāo)，包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）mRNA、中期因子（midkine,MK）mRNA、肺癌特異性X蛋白（Lunx）mRNA，以評價(jià)DC/ CIK細(xì)胞免疫治療在維持治療中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年8月至2016年3月在本院經(jīng)病理（包括經(jīng)皮肺穿刺活檢病理、纖維支氣管鏡活檢及術(shù)后病理）和基因檢測后確診為EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者120例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對照組各60例。治療組男18例，女42例；年齡28～65（45.69±4.89）歲；病程4.5～14.6（6.89±0.98）個月；疾病分期：Ⅲb期23例，Ⅳ期37例。對照組男21例，女39例；年齡31～67（44.91±5.03）歲；病程3.2～11.4（6.63±1.09）個月；疾病分期：Ⅲb期22例，Ⅳ期38例。兩組患者性別、年齡、病程和疾病分期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 方法 治療組在化療結(jié)束14d后實(shí)施DC/CIK細(xì)胞免疫治療；對照組定期隨訪，隨時(shí)監(jiān)測，直至病情出現(xiàn)進(jìn)展。

1.2.1 DC/CIK細(xì)胞的制備 抽取120例肺腺癌患者外周靜脈血100ml，3 000r/min離心10min，分離單個核細(xì)胞。使用0.9%氯化鈉溶液對分離出來的單個核細(xì)胞連續(xù)洗滌3次。隨后對單個核細(xì)胞分別進(jìn)行DC和CIK培養(yǎng)。培養(yǎng)當(dāng)日先用含有各種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)DC，換液時(shí)間為半天；用無血清生長培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK，平均每2～3d更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)7d后，收集CIK和DC，按1∶10比例聯(lián)合共同培養(yǎng)。培養(yǎng)第11天，檢測其細(xì)菌、真菌等微生物的培養(yǎng)情況，各項(xiàng)指標(biāo)均合格后，收集共培養(yǎng)的DC/CIK細(xì)胞。使用無菌0.9%氯化鈉溶液對共培養(yǎng)的DC/CIK細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)洗滌3次，然后分裝成5袋，每袋加入約5%的人血清白蛋白?；颊呙刻旎剌?袋，規(guī)定6d為1個療程，連續(xù)治療2個療程。通常是第1次治療時(shí)間為半個月，治療1個月后再進(jìn)行第2次治療，再隔1個月進(jìn)行第3次治療。每一階段結(jié)束治療后，抽取所有患者靜脈血5ml，對其外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行檢測。DC/CIK細(xì)胞的制備及治療流程圖見表1。

表1 DC/CIK細(xì)胞的制備及治療流程圖

1.2.2 RT-PCR法檢測外周血中微轉(zhuǎn)移指標(biāo) 應(yīng)用RT-PCR法對外周血中微轉(zhuǎn)移指標(biāo)進(jìn)行檢測，RNA提取完全按照Trizol總RNA提取試劑盒說明書 (北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。按照引物設(shè)計(jì)原則對3種指標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。CEA mRNA，正向：5′-TAGCTACTTACTACTTACTACTCCT-3′，反向：5′-CTTTTGTCCCGGCACATCGGGC-3′，探針：5′-TGTATCGGGACGTGCACAAAGACAG-3′；MK mRNA，正向：5′-CATCACACGCACCCCAGTT-3′，反向：5′-ATTGCGGCGTGGGTTTC-3′，探針：5′-CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3′；Lunx mRNA，正向：5′-AAGTCTGTTGAGGCTGGCTG-3′，反向：5′-GCCAAGTCCATCAAGCAGAG-3′，探針：5′-FAM-CCTCAACAGACTTGCACCGACCA-TAMRA-3′。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 觀察患者腫瘤的PFS PFS指患者從入組開始至復(fù)發(fā)或死亡的時(shí)間，或至因疾病進(jìn)展而停藥的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)檢測結(jié)果比較 治療組治療1個月和3個月后3種指標(biāo)的表達(dá)量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。同時(shí)兩組在治療1個月和3個月后3種指標(biāo)的表達(dá)量均較治療前明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2和圖1。治療3個月后，對照組有38例患者CEA mRNA達(dá)到了108copies/ml以上，有32例患者M(jìn)K mRNA達(dá)到了109copies/ml以上，有35例患者Lunx mRNA達(dá)到了109copies/ml。

表2 兩組治療前后外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)檢測結(jié)果比較(copies/ml)

圖1 兩組患者治療前后外周血微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的表達(dá)結(jié)果

2.2 兩組患者腫瘤的PFS比較 兩組患者腫瘤的中位PFS分別是3.10和2.52個月，95%CI分別是2.89～3.51和2.37～2.69個月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 兩組患者腫瘤的PFS比較

3 討論

近年來隨著環(huán)境惡化、壓力的增加，惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對人類的健康造成了極大的危害。肺癌位居惡性腫瘤發(fā)病率首位，晚期肺腺癌已經(jīng)成為肺癌的常見病理類型，對其診斷治療的研究已經(jīng)引起了極大的關(guān)注。目前臨床上對于一線化療結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定的肺腺癌患者，通過測定外周血或組織中EGFR基因突變與否來決定下一步治療。對于EGFR基因存在突變的患者，一般建議口服TKI靶向藥物[8]。TKI藥物不良反應(yīng)較小，服用方便，尤其對EGFR基因突變的肺腺癌患者療效滿意[9]。這種藥物不是以殺死腫瘤細(xì)胞為目的，主要是以細(xì)胞內(nèi)特異性或高表達(dá)的或腫瘤細(xì)胞膜上的分子作為靶點(diǎn)，阻止其生長或誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)降低了對正常細(xì)胞的殺死作用。但是對這種靶向藥物的應(yīng)用存在一些局限，尤其當(dāng)病情發(fā)生進(jìn)展后可選擇的治療措施減少，通常產(chǎn)生許多不良反應(yīng)并且不能徹底清除腫瘤細(xì)胞[10]。另外，TKI藥物對EGFR基因無突變的肺腺癌晚期患者的治療效果不佳。目前對EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者，在放化療結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定，下一步如何維持治療成為難題。

維持治療是指在初始治療獲得成功控制后，有助于阻滯腫瘤發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)措施，主要有疫苗、抗體以及藥物等[11]，是指在一線治療后給予鞏固治療或序貫治療以維持療效，以期延長生存時(shí)間和提高生活質(zhì)量的目的[12]。目前臨床應(yīng)用的多種維持治療方案存在許多弊端，比如患者會出現(xiàn)不耐受，免疫排斥以及長久的使用會出現(xiàn)耐藥等[13]。DC/CIK是一種新型的免疫生物治療方法，這種方法是利用自體免疫細(xì)胞進(jìn)行簡單處理后回輸患者體內(nèi)，克服了既往療法的很多缺點(diǎn)[14]。已經(jīng)有研究報(bào)道，DC/CIK細(xì)胞治療在別的疾病的維持治療中可以有明顯的效果，延長了患者的生存時(shí)間，改善了生活質(zhì)量[15-17]，但是尚未見文獻(xiàn)報(bào)道此方法在EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者中進(jìn)行維持治療的效果。

本研究主要是針對入組一線化療后病情達(dá)到穩(wěn)定控制后的EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者，采集患者外周靜脈血，體外制備成DC/CIK細(xì)胞，定期回輸給患者，采用RT-PCR法檢測外周血中CEA mRNA、MK mRNA、Lunx mRNA這些微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的表達(dá)情況，觀察治療前后患者外周血中微轉(zhuǎn)移變化情況。通過本課題的研究，筆者發(fā)現(xiàn)治療組治療1個月和3個月后3種指標(biāo)的表達(dá)量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組和對照組腫瘤的中位PFS分別是 3.10和2.52個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過DC/CIK細(xì)胞免疫治療后，盡管一些患者最終仍會面臨一些病情的變化，但是此方法已經(jīng)初步達(dá)到了延長生存時(shí)間，改善生活質(zhì)量的效果，為EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者維持治療提供了新的治療方案。后續(xù)筆者將會進(jìn)一步優(yōu)化方法，比如結(jié)合其他一些血液指標(biāo)，更快速地反映病情的變化，更及時(shí)地采取免疫治療；另外，加大樣本量，進(jìn)一步探索此方法的有效性和安全性，期望能夠達(dá)到更大的臨床療效。

因此本研究得出自體DC/CIK細(xì)胞治療方法在EGFR基因突變陰性的晚期肺腺癌患者維持治療過程中達(dá)到了初步的療效，一定程度上改善了生存質(zhì)量，為臨床治療此類患者提供了新思路。

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DC/CIK immunotherapy for patients with advanced lung cancer with negative EGFRgene mutation

LU Huadong,MA Zhihong,LIU Zhicong,et al.Department of Respiratory Medicine and Intensive Care Unit,Huzhou Central Hospital,Huzhou 313003, China

Objective To evaluate the clinical effect of DC/CIK immunotherapy in treatment of advanced lung adenocarcinoma patients with negative epidermal growth factor receptor(EGFR)gene mutation. Methods One hundred and twenty advanced lung cancer patients with negative EGFR gene mutation were randomly divided into two groups with 60 cases in each group.Patients in treatment group received DC/CIK immunotherapy and those in control group were followed up only.Real-time PCR was used to examine the expression of CEA mRNA,MK mRNA and Lunx mRNA.Progression free survival(PFS)was used to monitor the change of clinical state after treatment with DC/CIK.And the results were analyzed statistically. Results The expression levels of CEA mRNA,MK mRNA and Lunx mRNA in treatment group were lower than those in control group 1 and 3 months after treatment(all P＜0.05).After 3 months,in control group there were 38 cases with CEA mRNA＞108copies/ml,32 cases with MK mRNA＞109copies/ml and 35 cases with Lunx mRNA＞109copies/ml.In treatment group there was significant difference in CEA mRNA and MK mRNA expression before and after DC/CIK treatment(all P＜0.05).The progression-free survival in treatment and control groups was 3.10 months and 2.52 months,respectively(P＜0.05). Conclusion DC/CIK immunotherapy can improve the quality of life and may be used as a maintenance treatment for patients with advanced lung adenocarcinoma.

Lung adenocarcinoma Dendritic cells-cytokine-induced killer cells Micrometastases Carcinoembryonic antigen mRNA Midkine mRNA Lung specific Xprotein mRNA Maintenance therapy

2016-12-25）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2016-2188

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺計(jì)劃（2015DTA016）

313003 湖州市中心醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科（陸華東、劉志聰、邱國琴、華鋒、崔恩海、王斌），中心實(shí)驗(yàn)室（馬志紅）

王斌，E-mail：3414169736@qq.com