羥基磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長因子-β1復(fù)合材料對糖尿病兔種植體周圍Runx-2/ALP/OC基因的影響*

劉星宇，雷婷婷，茍?jiān)娙?，鄭立舸，?玲，牟雁東

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科/西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院/口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院規(guī)劃財(cái)務(wù)部，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

羥基磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長因子-β1復(fù)合材料對糖尿病兔種植體周圍Runx-2/ALP/OC基因的影響*

劉星宇1,2，雷婷婷3，茍?jiān)娙?，鄭立舸2△，郭 玲1，牟雁東2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科/西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院/口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院規(guī)劃財(cái)務(wù)部，四川瀘州 646000)

目的 將制備的羥基磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長因子-β1緩釋微球復(fù)合涂層種植體運(yùn)用于糖尿病兔脛骨，探討其周圍Runx-2/ALP/OC基因表達(dá)的改變，從分子水平評(píng)估該種植體的成骨性。方法 制備復(fù)合涂層種植體，運(yùn)用掃描電鏡(SEM)分析其表面形貌。并建立SPF 級(jí)新西蘭兔 2 型糖尿病模型，分別在其脛骨干骺端植入種植體，分別于術(shù)后 4、8、12周，取出帶種植體周圍骨組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)分別檢測普通圖和糖尿病兔在不同種植體植入后Runx-2、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的表達(dá)量。結(jié)果 Runx-2、ALP、OC在改性涂層種植體表面的mRNA表達(dá)在同一時(shí)間點(diǎn)上，改性種植體組的表達(dá)量高于普通種植體組;不同時(shí)間點(diǎn)上，使用改性種植體的Runx-2、ALP、OC的基因表達(dá)量增加高于普通種植體,正常兔改性種植體基因表達(dá)最高。結(jié)論 復(fù)合涂層種植體能促進(jìn)高糖環(huán)境下Runx-2/ALP/OC基因表達(dá)，具有一定的臨床運(yùn)用前景。

糖尿?。荒孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；種植體；表面改性

種植義齒是目前治療牙列缺損或缺失的較為理想的修復(fù)方式，而糖尿病(DM)作為一種全身性疾病成為種植手術(shù)的相對禁忌證，如何提高DM患者種植體的骨結(jié)合是目前一個(gè)急需解決的問題。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)[1]的基礎(chǔ)上，對羥基磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長因子-β1緩釋微球復(fù)合涂層種植體進(jìn)行進(jìn)一步的研究，將其運(yùn)用于DM兔上，驗(yàn)證其成骨效能，為今后的臨床運(yùn)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡健康雄性新西蘭大白兔(西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。實(shí)驗(yàn)試劑與材料：納米羥基磷灰石(HA Sigma,美國)；明膠粉劑(Sigma,美國)；TGF-β1及ELISA試劑盒(Cloud-clone,美國)；四氧嘧啶(Sigma，美國)；精蛋白長效胰島素(30R諾和諾德中國制藥有限公司)；血糖儀及配套血糖試紙(羅氏卓越血糖儀)；自行設(shè)計(jì)種植體(3.3 mm×4.0 mm)。實(shí)驗(yàn)儀器：QUANTA 200掃描電子顯微鏡(SEM，F(xiàn)EI，荷蘭)；微弧氧化電源(中南民大等離子體研究所)；低溫離心機(jī)(C2500，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠)熱循環(huán)儀(TCA0096 Thermo Fisher,美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀(PIKORed 9，Thermo Fisher,美國)。

1.2 方法

1.2.1 HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層種植體的制備 HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層的制備見前置實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用此方式，將復(fù)合涂層加載于種植體表面[1]。

1.2.2 動(dòng)物建模及分組 選取雄性的新西蘭大白兔共29只，體質(zhì)量為(2.79±0.24)kg。以100 mg/kg的計(jì)量計(jì)算并經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射新鮮配制的5%四氧嘧啶溶液。于藥物注射后的2、4、6 h 分別于新西蘭兔的皮下注射 5%葡萄糖溶液3 mL。建模期間，每天檢測血糖1次，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖穩(wěn)定后每3天檢測血糖1次。以平均每日血糖穩(wěn)定于 13.9 mmol/L(25 mg/L)以上為建模成功。將建模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只分為如下4組，A組(正常兔普通種植體)，B組(正常兔改性種植體)，C組(DM普通種植體)，D組(DM改性種植體)；當(dāng)兔仰臥平躺時(shí)，每只兔右腳為普通種植體，左腳為改性種植體。

1.2.3 種植體植入 用戊3%巴比妥鈉(40 mg/kg)，耳緣靜脈注射以麻醉動(dòng)物。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)區(qū)備皮消毒，沿脛骨上端內(nèi)側(cè)平面切開，分離肌肉及筋膜完全暴露脛骨面；用生理鹽水讓術(shù)區(qū)冷卻，使用種植機(jī)于脛骨平面中央逐級(jí)預(yù)備種植窩，并植入復(fù)合涂層種植體(圖1)，深度約2 mm，分層嚴(yán)密縫合。術(shù)后每日肌內(nèi)注射40 萬U的硫酸慶大霉素，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物愈合情況。

1.2.4 RT-PCR檢測特定基因

1.2.4.1 RNA的提取與轉(zhuǎn)錄 于術(shù)后第 4、8、12 周，普通兔組、DM兔組各處死4只新西蘭兔，取雙側(cè)脛骨(圖2)種植體周0.8 cm×0.8 cm×1.0 cm的骨塊，經(jīng)錫箔紙雙側(cè)包裹并編號(hào)后，溫度于80 ℃保存。待3批樣本收集齊后，液氮下無菌研磨、離心、振蕩、靜置、提取含有RNA的上清液，將提取出的 RNA 于-20 ℃ 保存。最后按照說明書依次加入各試劑，置PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，完成逆轉(zhuǎn)錄。

圖1 免脛骨植入 圖2 免脛骨改性種植體

改性種植體 骨結(jié)合情況

1.2.4.2 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR反應(yīng) 所有引物均交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，所用引物及堿基序列如表1。按照說明書相關(guān)使用要求，應(yīng)用Smart Cycler System RT-PCR Ⅱ擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程各檢測樣本的CT(Threshold cycle)值，本實(shí)驗(yàn)室通過2-△△CT計(jì)算X相對mRNA表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參。

表1 PCR引物及堿基序列(3′～5′)

2 結(jié) 果

2.1 種植體的表面形態(tài) 由掃描電子顯微鏡(SEM)分別掃描微弧氧化后種植體和加載蛋白后改性種植體表面，可知種植體表面存在大量加載TGF-β1蛋白的明膠微球，明膠微球表面可見蛋白吸附，測得該微球球徑為8～30 μm，見圖3、4。

箭頭：微孔。

圖3 微弧氧化后種植體的表面微孔掃描電鏡觀察(×10 000)

箭頭：加載蛋白。

圖4 微弧氧化后種植體的表面微孔掃描電鏡觀察(×500)

2.2 DM模型的建立 除兩只動(dòng)物建模時(shí)死亡，其余動(dòng)物建模成功。建模后，模型組新西蘭兔空腹血糖由(5.93±0.66)mmol/L增高到(18.61±4.87)mmol/L，穩(wěn)定于13.8 mmol/L以上。而對照組血糖為(6.12±0.62)mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 2-△△CT法轉(zhuǎn)換后不同時(shí)間點(diǎn)上各基因表達(dá)比較 使用改性種植體的兔子(B、D組)，Runx-2、ALP、OC的mRNA表達(dá)在同一時(shí)間點(diǎn)上高于普通種植體的兔子(A、C組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，正常兔子改性種植體基因表達(dá)最高，DM兔改性種植體率與正常兔子正常種植體的基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DM兔正常種植體最低。而隨著時(shí)間的增加，使用改性種植體的Runx-2、ALP、OC的基因表達(dá)量增加高于普通種植體(P<0.05)。AGEs的表達(dá)在普通兔子上，使用普通種植體隨時(shí)間遞增比改性種植體較快(P<0.05)，而在DM兔上，使用改性種植體后，AGEs遞減較快，普通種植體不變,見表2、圖5。

表2 2-△△CT法轉(zhuǎn)換后不同時(shí)間點(diǎn)上各基因表達(dá)比較±s,n=4)

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)上各基因表達(dá)比較

圖6 部分基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線

3 討 論

DM是一種常見的慢性全身性疾病，WHO發(fā)布《全球糖尿病報(bào)告》來看，目前DM已成為重大的公共衛(wèi)生問題。以往的研究表明，DM患者的種植體成功率遠(yuǎn)低于健康人，因此對于DM患者種植體周圍健康狀況，不僅應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行治療，更應(yīng)該提前預(yù)防，以達(dá)到更好的修復(fù)效果[2-7]。

早期更好的骨整合與結(jié)合強(qiáng)度是口腔種植材料研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對種植體進(jìn)行表面改性，使其表面緊密吸附一層均勻的復(fù)合涂層，使種植體具有生物功能性，另一方面表面積增加了的種植體具有更高的骨結(jié)合率[8-9]。由電鏡來看，種植體表面存在大量的載蛋白微球，這與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[1]。擴(kuò)大了種植適應(yīng)證，尤其是全身性疾病(如DM、骨質(zhì)疏松等)的患者時(shí)，單一鈦種植體表面改性已不能滿足目前的臨床要求，結(jié)合理、化、生物方法及材料優(yōu)點(diǎn)的改性技術(shù)以后必然的發(fā)展方向[10]。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選取了Runx-2、ALP，AGEs和OC這幾個(gè)在糖尿病成骨中有標(biāo)志性的基因進(jìn)行檢測，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知Runx-2、ALP、OC的mRNA表達(dá)在同一時(shí)間點(diǎn)上改性種植體的成骨性要高于普通種植體，DM兔改性種植體率與正常兔子正種植體的基因表達(dá)相近。這說明使用復(fù)合涂層種植體后，對兔的成骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，這可能與復(fù)合涂層中存在的TGF-β有關(guān)。Liu等[11]研究表明，BMP信號(hào)和Runx-2存在相關(guān)性，這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)在成骨細(xì)胞分化過程中有著十分重要的作用。而在加入TGF-β后細(xì)胞Runx-2、BMP2 mRNA表達(dá)增加，表明細(xì)胞分化成骨能力增加，Sun等[12]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子信號(hào)通路是一個(gè)重要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的礦化，加入TGF-β將影響ALP和OC的表達(dá)。這都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。同時(shí)，改性種植體組中的ALP基因的表達(dá)量在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的早期都維持在一個(gè)較高的水平,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通種植體組，這可說明在成骨的早期,該復(fù)合涂層種植體提供羥基磷灰石對動(dòng)物骨的礦化過程有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，復(fù)合涂層種植體能有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的基因的表達(dá)和其鈣離子的釋放，從而對成骨細(xì)胞的活性和礦化有一定作用。與此同時(shí)，在使用同種類型種植體時(shí)DM組的Runx-2、ALP和OC表達(dá)量少于正常兔子組，說明DM確實(shí)會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的成骨能力下降。這可能DM的骨代謝有關(guān)系密切，DM動(dòng)物存在著鈣磷及維生素D代謝異常，高血糖，糖基化終末產(chǎn)物，細(xì)胞因子與Wnt信號(hào)途徑異常等問題，這些都可能造成糖尿病骨代謝異常從而誘發(fā)病理改變?nèi)绻怯喜涣己凸窃偕芰κ軗p等問題從而影響標(biāo)志性基因的表達(dá)[13-14]。

與上述基因不同，AGEs是一種與DM有密切關(guān)系的產(chǎn)物，是在非酶促條件下,蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產(chǎn)生一組穩(wěn)定的終末產(chǎn)物[15-16]。組織中AGEs水平在一定程度上能反映DM腎病的嚴(yán)重程度,同時(shí)AGEs可與成骨細(xì)胞表面的受體RAGE結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞分化，使成骨細(xì)胞成骨能力下降[17]。本實(shí)驗(yàn)中，圖通AGEs的表達(dá)量在普通兔子使用普通時(shí)種植體隨時(shí)間遞增較快，而使用改性種植體遞增較慢，但二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明在普通兔上，AGEs表達(dá)改變不明顯，而在DM兔上，使用改性種植體后，AGEs遞減迅速，普通種植體不變。這說明復(fù)合涂層種植體在可抑制AGEs的表達(dá)，從而促進(jìn)DM動(dòng)物的成骨，可能原因是與AGEs與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)，而復(fù)合涂層種植體通過TGF-β1的過表達(dá)來抑制AGEs從而在DM中起到骨保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)使用的復(fù)合涂層改性種植體，在DM動(dòng)物體內(nèi)對于成骨具有明顯的促進(jìn)作用，該材料有望進(jìn)一步研究以期以后的臨床運(yùn)用。

[1]茍?jiān)娙?張帆,李萌婷,等.鈦表面羥磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長因子-β1緩釋微球復(fù)合涂層的制備及其對成骨細(xì)胞黏附與增殖的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016,34(3):229-233.

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Investigation of hydroxyapatite/chitosan-TGF-β1 composite coatings on implant surfaces and its effect on the maker gene Runx 2/ALP/OC of diabetic rabbit osteoblasts*

LiuXingyu1,2,LeiTingting3,GouShiran1,ZhengLige2△,GuoLing1,MuYandong2

(1.DepartmentofProsthodontics,theAffiliatedHospitalofStomatologyofSouthwestMedicalUniversity/Laboratory&OralandMaxillofacialReconstructionandRegenerationInstituteofCardiovascularMedicine,SouthwestMedicalUniversity/Luzhou,Sichuan646000,China;2.StateKeyLaboratoryofOralDiseases&theAffiliatedWestChinaStomatologyHospitalofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China;3.DepartmentofPlanningandFinance,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective This study investigated the effects of hydroxyapatite (HA)/chitosan (CS)-transforming growth factor-β1 (TGF-β1) composite coatings on implant surfaces,as well as on the symbol gene of diabetic rabbit osteoblasts.Methods Coatings were prepared on implant surfaces and studied by scanning electric microscope (SEM),New Zealand White rabbits were used to establish the model of type 2 diabetes.Implant the implants in tibial metaphysis of the rabbit and took them and surrounding bone tissue our after 4,8,12 weeks.Detcet the expression of AGEs,ALP,OC,Runx-2 mRNA by semi-quantitative RT-PCR.Results The expression level of Runx-2,ALP and OC mRNA on composite coatings implants tended to be higher than that on normal implant at each time point.The same differences occurred at different points in time,especially the implants in normal rabbits.Conclusion The composite coatings implants significantly promote the proliferation of osteoblast and the expression of Runx-2,ALP and OC in high glucose,and it’s worth of further clinical use.

diabetes mellitus;reverse transcriptase polymerase chain reaction;implant;surface modification

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.006

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLOD2015OF09)；四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(16PJ173)。 作者簡介：劉星宇(1990-)，碩士，主要從事口腔修復(fù)學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:541148817@qq.com。

R783.4

A

1671-8348(2017)08-1023-04

2016-07-22

2016-09-20)