水飛薊果托總黃酮的純化工藝及其對油脂的抗氧化研究

任明婧，查恩輝，孫 晶

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121001)

水飛薊果托總黃酮的純化工藝及其對油脂的抗氧化研究

任明婧，查恩輝，孫 晶

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121001)

通過大孔樹脂吸附率與解吸率的測定，篩選適合對水飛薊果托總黃酮進行純化的最佳樹脂類型；通過研究不同因素對樹脂吸附和解析效果的影響，確定水飛薊果托總黃酮的純化工藝，并研究其對油脂的抗氧化作用。研究結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂最適合水飛薊果托中總黃酮的純化，吸附平衡時間為4 h，解析平衡時間為3 h；在水飛薊果托總黃酮質(zhì)量濃度3.98 mg/ml，pH5.5，吸附溫度50℃，解吸溫度60℃，用體積分數(shù)70%的乙醇進行解析時，果托總黃酮的純化效果較好。在上述條件下制得的果托總黃酮產(chǎn)品為黃色粉末，回收率為82.04%，純度為68.07%。油脂抗氧化試驗結(jié)果表明，添加2 mg水飛薊果托總黃酮比添加2 mg維生素C抗氧化效果明顯。

水飛薊果托；黃酮；純化；抗氧化

水飛薊是一種菊科藥用植物，原產(chǎn)于北非，上世紀七十年代引入我國后被廣泛推廣種植[1]。水飛薊果實中的水飛薊素，屬于黃酮類物質(zhì)，具有抗肝中毒、抗腫瘤、降血脂等活性，以水飛薊素為主要成分的藥劑已在臨床用于治療肝炎和膽囊炎等疾病[2-4]。德國首先開發(fā)出水飛薊素提取物作為治療肝炎的藥物(Legalon)，近年我國也已開發(fā)出相關(guān)藥物，其中水飛薊素制劑——益肝靈片已在臨床上廣泛使用[5-6]。水飛薊果實還可用于生產(chǎn)水飛薊油和水飛薊蛋白等產(chǎn)品，而果托作為主要的副產(chǎn)物，其利用情況目前鮮有報道。水飛薊果托的研究與利用，可使其變廢為寶，增加水飛薊及相關(guān)產(chǎn)品的附加值。

目前國內(nèi)外對于水飛薊種子中水飛薊素等活性物質(zhì)的利用方面的研究較多[7-8]，有關(guān)水飛薊植株中活性物質(zhì)的研究僅國外有少量報道，并且主要是對根、莖、葉等部位的研究[9-12]。課題組前期研究結(jié)果表明，水飛薊果托中總黃酮含量高于根、莖、葉等部位[13]。本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上，對水飛薊果托總黃酮的純化工藝及其對油脂的抗氧化活性進行研究，國內(nèi)外均未見報道。

以水飛薊果托為原料，首先確定果托總黃酮純化的最佳樹脂，然后通過分析各因素對吸附和解吸效果的影響，確定總黃酮純化工藝條件，最后對其油脂抗氧化活性進行研究，以期為水飛薊果托總黃酮的利用及活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水飛薊果托，盤錦天源藥業(yè)集團提供，采收于2015-07，26～28℃條件下陰干，于密閉塑料袋中-17℃冷藏保存；大豆油和豬油均為市售。

亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑,均為分析純。

1.2 儀器

DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱,高速萬能粉碎機,KQ-3200B型超聲波清洗器,UV-6300型紫外分光光度計,循環(huán)水式真空泵，R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHA-BA型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器。

1.3 水飛薊果托中總黃酮提取液的制備

將干燥的水飛薊果托打碎成粉末，過60目篩，稱取一定量的水飛薊果托粉末于錐形瓶中，在溫度55℃、液料比30∶1、乙醇體積分數(shù)60%、提取時間100 min后抽濾，濃縮到無乙醇味道，置于50℃真空箱內(nèi)進行干燥，并將干燥品按要求稀釋成一定濃度的樣液，待用[13]。

1.4 樹脂的預處理

首先將7種大孔樹脂分別用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，然后用無水乙醇進行淋洗，直至洗出液加水不產(chǎn)生白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水洗去殘留乙醇，最后吸干樹脂中的水分殘留[14]。

1.5 指標測定與方法

1.5.1 水飛薊果托總黃酮含量的測定

水飛薊果托總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。以吸光度(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程y=8.748 6x+0.006 1，R2=0.999 1。根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮濃度[13]。

1.5.2 樹脂的吸附率和解吸率的測定

精確稱取預處理后大孔樹脂2 g，置于錐形瓶中，加入濃度為1.17 mg/ml的果托總黃酮溶液，置于振蕩器中振蕩24 h(30℃，110 r/min)，測定黃酮溶液的濃度；洗去飽和樹脂表面殘留黃酮，吸干水分，加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，振蕩24 h(30℃，110 r/min)，使之充分解吸后過濾，測定濾液總黃酮濃度，通過下式計算吸附率和解析率[14]。

式中，α為吸附率，%；C0為黃酮溶液初始濃度，mg/ml；C1為吸附平衡后黃酮溶液濃度，mg/ml；Qa為吸附量，mg/g；Va為黃酮溶液體積，ml；W為樹脂質(zhì)量，g；Qd為解析量，mg/g；Cd為解析液濃度，mg/ml；Vd為解析液體積，ml；β為解析率，%。

1.5.3 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上吸附平衡時間測定

稱取預處理后的大孔樹脂2g，置于錐形瓶中，加入60ml果托總黃酮溶液，將錐形瓶放入振蕩器中(30℃，110r/min)，每隔0.5h測定一次吸附量。

1.5.4 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上解吸平衡時間測定

稱取吸附水飛薊果托總黃酮溶液的飽和樹脂2g，置于錐形瓶中，加入25ml體積分數(shù)60%的乙醇溶液，將錐形瓶放入振蕩器中(30℃，110r/min)，每隔0.5h測定一次解吸率。

1.5.5 水飛薊果托總黃酮回收率和純度測定

將一定濃度的水飛薊果托總黃酮溶液按照得到的純化工藝條件進行吸附和解吸處理，收集洗脫液并測量其總黃酮濃度，然后將洗脫液濃縮干燥后稱重，通過下述公式計算后可得果托總黃酮純度與回收率[14]。

純度=(X×V)/G×100%，

1.6 各因素對大孔樹脂吸附或解析的影響

1.6.1 水飛薊果托總黃酮濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

精確稱取預處理后的大孔樹脂若干份，每份2 g，置于錐形瓶中，加入pH5.5的果托總黃酮溶液各60 ml，濃度分別為1.14、2.05、3.98、6.17、8.45、10.43 mg/ml,將錐形瓶放入振蕩器中(30℃，110 r/min，4 h)，待吸附平衡后測定濃度，計算吸附率和吸附量。

1.6.2 水飛薊果托總黃酮溶液pH值對大孔樹脂吸附效果的影響

將濃度為3.98 mg/ml的果托總黃酮用緩沖溶液配置成pH值依次為4.5、5、5.5、6、6.5和7的六種溶液，取60 ml配置后的黃酮溶液放入盛有2 g樹脂的錐形瓶中，振蕩(30℃，110 r/min，4 h)，計算吸附率。

1.6.3 乙醇濃度對大孔樹脂解吸量的影響

取吸附水飛薊果托總黃酮粗提液的飽和樹脂2 g若干份，分別加入25 ml體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，將錐形瓶放入振蕩器中(30℃，110 r/min，1.5 h)，測定洗脫液中果托總黃酮濃度，計算解吸量。

1.6.4 溫度對大孔樹脂吸附和解吸效果的影響

配制濃度為3.98 mg/ml，pH5.5的果托總黃酮粗提液，取60 ml放入錐形瓶中，加入預處理后的樹脂2 g，不同溫度條件下振蕩(110 r/min，4 h)，計算總黃酮吸附量；分別稱取吸附果托總黃酮的飽和樹脂2 g，加入25 ml體積分數(shù)60%的乙醇溶液，不同溫度條件振蕩(110 r/min，1.5 h)，計算解吸量。

1.7 果托總黃酮對油脂的抗氧化試驗

分別稱取純化后的果托總黃酮粉末1.0、1.5、2.0 mg，并稱取2 mg維生素C作為陽性對照，用1 ml無水乙醇溶解后放入盛有50 ml大豆油或30 g豬油的三角瓶中，搖勻；另取一個三角瓶，只加入50 ml大豆油或30 g豬油作為空白對照。將所有試樣放入振蕩器中，60℃條件下恒溫振蕩，每隔一定時間取樣測定其過氧化值[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂對水飛薊果托總黃酮吸附和解吸特性比較

從表1可知，弱極性的AB-8、D-130以及極性的S-8對水飛薊果托總黃酮的吸附量較大，極性的NKA-9因比表面積過小，吸附量較小，因為樹脂比表面積的大小，預示著吸附量的大小。X-5和HPD-100雖然是非極性樹脂，但由于比表面積大，具有一定的吸附能力，同時解析率也大，其中，S-8的解析率處于最低。

因此，通過對不同類型的樹脂性能進行比較，初步選擇AB-8，D-130，X-5，HPD-100進行靜態(tài)吸附和解析動力學研究。

2.2 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上的靜態(tài)吸附動力學曲線

由圖1可知，0～4 h內(nèi)，AB-8大孔樹脂的吸附量隨著吸附時間的延長而急劇增加，5 h后吸附接近飽和；HPD-100在前3 h的吸附量均低于其他三種，3 h后與X-5和D-130吸附量相接近，但都低于AB-8大孔樹脂。

表1 不同大孔樹脂對水飛薊果托總黃酮的 靜態(tài)吸附率和解吸率的比較

圖1 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上

靜態(tài)吸附動力學曲線圖

2.3 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上的靜態(tài)解吸動力學曲線

由圖2可知，在靜態(tài)解吸過程中的前2 h內(nèi)，AB-8樹脂的解吸率急劇上升，在2～3 h解吸率增長緩慢，解吸3 h達到峰值，之后基本保持不變。AB-8的解吸率可達到76%，且一直保持最大，而D-130，X-5的解吸率較小。

圖2 水飛薊果托總黃酮在大孔樹脂上的 靜態(tài)解吸動力學曲線圖

綜合考慮大孔樹脂對總黃酮的吸附量和解析率的影響，上述四種樹脂中，AB-8型大孔樹脂是最適合分離純化水飛薊果托總黃酮類物質(zhì)的樹脂。

2.4 水飛薊果托總黃酮濃度對AB-8大孔樹脂吸附的影響

水飛薊果托總黃酮濃度對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響如圖3所示。隨著濃度的增大，AB-8大孔樹脂對水飛薊果托中總黃酮的吸附率降低，而吸附量的變化與之相反。當溶液濃度大于8.45 mg/ml時，吸附量基本不再變化，說明當溶液濃度為8.45 mg/ml時，總黃酮吸附量已接近飽和。當溶液濃度為3.98 mg/ml時，總黃酮吸附率較高，吸附量增加率最大，從節(jié)約總黃酮溶液和樹脂兩方面考慮，選擇總黃酮最適吸附濃度為3.98 mg/ml。

圖3 水飛薊果托總黃酮濃度對AB-8大孔樹脂 吸附效果的影響

2.5 水飛薊果托黃酮溶液的pH值對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響

如圖4所示，AB-8型樹脂對水飛薊果托粗提液總黃酮的吸附能力受pH值的影響較大。在弱酸條件下，黃酮類化合物以分子狀態(tài)存在，可通過范德華力吸附在樹脂上，因此吸附率較高[14]。當pH值在4.5～7內(nèi)時，AB-8型樹脂對水飛薊果托粗提液總黃酮的吸附率呈先上升后下降的趨勢，當pH值為5.5時，吸附率最大，所以確定5.5為上樣液合適的pH值。

圖4 上樣液pH值對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響

2.6 乙醇體積分數(shù)對AB-8大孔樹脂解吸效果的影響

如圖5所示，在50%～70%內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮解吸率逐漸增大；當乙醇體積分數(shù)達到70%時，解吸率最大；當乙醇體積分數(shù)超過70%后，解吸率略有下降。所以確定體積分數(shù)70%的乙醇溶液濃度為最佳的洗脫濃度。

圖5 乙醇體積分數(shù)對AB-8型樹脂解吸效果的影響

2.7 溫度對AB-8大孔樹脂吸附和解吸的影響

從圖6可以看出，在30～50℃內(nèi)，果托總黃酮吸附量隨溫度升高而增加，當大于50℃時，隨溫度升高，果托總黃酮吸附量明顯下降，因此，選擇吸附溫度為50℃。

在30～60℃內(nèi)，隨著溫度的升高，果托總黃酮解吸量增加，60℃時到達峰值。當溫度高于60℃時，解吸量開始下降，分析原因可能是溫度較高時部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生分解，因此,選擇解吸溫度為60℃。

圖6 溫度對樹脂吸附或解析的影響

2.8 水飛薊果托總黃酮回收率和純度的測定

在水飛薊果托總黃酮濃度為3.98 mg/ml、pH5.5、乙醇體積分數(shù)70%、吸附溫度50℃、解析溫度60℃的條件對水飛薊果托總黃酮進行純化，純化后的果托總黃酮為黃色粉末，經(jīng)測定，果托總黃酮純度為(68.07±1.40)%，回收率為(82.04±1.85)%。

2.9 水飛薊果托總黃酮對油脂的抗氧化活性

2.9.1 水飛薊果托總黃酮對大豆油的抗氧化活性

不同添加量的果托總黃酮與維生素C對大豆油的抗氧化效果比較結(jié)果如表2所示。

由表2可知，空白對照組POV值高于所有添加果托總黃酮試驗組，說明果托總黃酮對大豆油具有一定的抗氧化效果。隨著果托總黃酮添加量的增加，其對大豆油的抗氧化作用逐漸增大，而且大豆油保藏時間越長，抗氧化效果越明顯。當果托總黃酮的添加量為2 mg時，其抗氧化效果比添加2 mg維生素C好，這說明水飛薊果托總黃酮對大豆油具有明顯的抗氧化作用。

表2 不同添加量果托總黃酮與維生素C 對大豆油的抗氧化效果

2.9.2 水飛薊果托總黃酮對豬油的抗氧化活性

不同添加量的果托總黃酮和維生素C對豬油的抗氧化效果比較見表3。

由表3可知，空白對照組POV值高于所有添加果托總黃酮試驗組，在試驗添加劑量范圍內(nèi)，果托總黃酮添加量與其對豬油的抗氧化效果成正比關(guān)系。當果托總黃酮添加量為2 mg時，比2 mg維生素C組對豬油的抗氧化效果好，說明果托總黃酮對豬油的抗氧化作用明顯。

表3 不同添加量果托總黃酮與維生素C 對豬油的抗氧化效果

3 結(jié)論

靜態(tài)吸附和解吸試驗結(jié)果表明，在7種試驗樹脂中，AB-8大孔樹脂吸附率大，解吸率高，對水飛薊果托總黃酮的吸附平衡時間為4 h，解吸平衡時間為3 h，是適合對水飛薊果托總黃酮進行純化的理想樹脂。

當水飛薊果托總黃酮濃度為3.98 mg/ml，pH5.5，吸附溫度為50℃時，AB-8大孔樹脂對水飛薊果托總黃酮的吸附效果較好。

用體積分數(shù)70%的乙醇溶液作為解吸液，解吸溫度為60℃時，水飛薊果托總黃酮的解析效果較好。

經(jīng)純化后得到的水飛薊果托總黃酮為黃色粉末，回收率為(82.04±1.85)%，純度為(68.07±1.40)%。

油脂抗氧化試驗結(jié)果表明，水飛薊果托總黃酮對大豆油和豬油均具有較好的抗氧化效果，添加2 mg水飛薊果托總黃酮比添加2 mg維生素C對油脂的抗氧化效果明顯。

[1] 余傳隆,黃泰康,丁志遵,等.中藥辭海(第一卷)[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出社,1993：963-964.

[2] 李 談,杜 勇,張小茜. 水飛薊質(zhì)量標準的研究[J]. 中國中藥雜志, 2006,31(2):165-167.

[3] 閏玉峰,于健東. 水飛薊的化學成分及藥理研究進展[J]. 中國藥事, 2000, 14(5):335-337.

[4] 朱 銥,鄭哲沫,崔京浩.水飛薊素及其制劑的研究進展[J].中國野生植物資源, 2002 (3):47-49.

[5] 常國彬,李季平.水飛薊及其藥用有效成分研究[J].遼寧師專學報,2004,6(1):24-25.

[6] 楊 晉,劉雅敏,劉延澤.水飛薊素藥學研究進展[J].人然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(2):185-187.

[7] 鄭巨約.水飛薊中有效成分的分離制備及其抗氧化活性[D] .杭州：浙江工商大學，2009.

[8] 劉 宏.水飛薊種子活性成分的提取、分離及初步活性研究[D] .北京：北京化工大學，2009.

[9] OMAR A A, HADAD G M, BADR J M. First detailed quantification of silymarin components in the leaves ofSilybummarianumL. cultivated in Egypt during different growth stages[J].Acta Chromatographica, 2012,24 (3):463-474.

[10] AHMAD N, FAZAL H, ABBASI B H.Evaluation of antioxidant activity and its association with plant development inSilybummarianumL. [J]. Industrial Crops and Products, 2013 (49):164-168.

[11] AHMAD N, FAZAL H, ABBASI B H, et al. DPPH free radical scavenging activity and phenotypic difference in hepatoprotective plant(SilybummarianumL.) [J]. Toxicology and Industrial Health, 2012,29 (5):460-467.

[12] BANNA H, RAMADAN S, SHALABY M, et al. Hepatoprotective and antioxidant effects of silybum marianum plant in rats[J]. International Journal for Agro Veterinary and Medical Sciences, 2011,5(6): 541-547.

[13] 孫 晶,狄 蕊,尚美秀. 超聲波輔助提取水飛薊全草中總黃酮的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2014, 24:239-242.

[14] 李穎暢, 孟憲軍, 李小紅.大孔樹脂純化藍莓葉總黃酮的工藝研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(1):133-137.

[15] 尹學瓊,陳俊華,劉 芳，等.檸檬香茅精油的提取及抗氧化活性[J]. 精細化工，2012，29(6):568-571.

(責任編輯：趙琳琳)

Purification process of total flavonoids from milk thistle fruit receptacles and its lipid-antioxidant activity

REN Ming-jing,CHA En-hui,SUN Jing

(College of Food Science and Enginering,Jinzhou Medical Univesity,Jinzhou 121001, China)

The best resin for purification of total flavonoids from milk thistle fruit receptacles were confirmed by determing adsorption rate and desorption rate of resin. The purification process of total flavonoids from milk thistle fruit receptacles were also studied by testing the influence of different factors on resin adsorption and desorption effects. AB-8 macroporous resin was confirmed to be suitable resin. The result indicated that appropriate purification parameters of flavonoids from milk thistle fruit receptacles with AB-8 macroporous resin were adsorption equilibrium time of 4 h, resolution equilibrium time of 3 h, total flavonoids mass concentration of 3.98 mg/ml, pH5.5, 70%(v/v) ethanol solution, adsorption temperature 30℃, desorption temperature 60℃. The total flavonoids produced by this proeess was yellow powder, reovery rate was 82.04%, the purity of flavonoids was 68.07%.The oil oxidation resistance test showed that the antioxidant activity of 2 mg flavonoids from milk thistle fruit receptacles was higher than that of vitamin C of 2 mg.

milk thistle fruit receptacles; flavonoids; purification；antioxidant activity

2016-10-20；

2017-03-20

遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(項目編號：2014037)；遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(項目編號：201510160000056)。

任明婧(1996-)，女，本科，專業(yè)為食品科學與工程。

孫 晶(1982-)，女，碩士，講師，專業(yè)為食品科學。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.04.008

TS202.3;S567.9

A

1003-6202(2017)04-0030-05