UPLC法分離飲料中7種合成著色劑的研究

趙 卉，胡夢(mèng)坤，岑 琴，彭 紅

（沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，沈陽 110022）

人工合成色素是以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)制成的。大量的研究報(bào)告指出，幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，某些合成色素甚至?xí)?dǎo)致生育力下降、畸胎等。因此，我國(guó)《GB2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)合成著色劑的使用有明確限量。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）與傳統(tǒng)的液相色譜（HPLC）相比，可大大改善分析速度、分離度和靈敏度，在食品安全、環(huán)境分析、藥物開發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。通過改變?cè)囼?yàn)條件，建立UPLC對(duì)飲料中檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅7種人工合成著色劑的分離分析方法，為快速識(shí)別和檢測(cè)合成著色劑提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）：美國(guó)waters公司；色譜柱Waters RP18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超純水制備系統(tǒng)：美國(guó)Milli-Q公司。

1.1.2 試劑 檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品 （純度＞99%）由DR.Ehrenstorfer GmbH生產(chǎn)；甲醇（色譜純）由美國(guó)fisher公司生產(chǎn)；乙醇、氨水、聚酰胺粉、甲酸、檸檬酸、乙酸銨均為分析純。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣 20 g（精確至 0.01 g），置于 100 mL燒杯中，加熱驅(qū)除 CO2；加檸檬酸（20 g/100 mL）調(diào)節(jié)試樣pH值為6，加熱至60℃，將1 g聚酰胺粉倒入試樣中，攪拌抽濾；用60℃水洗滌后，再用甲醇-甲酸（6+4）溶液洗滌3～5次，再用水洗至中性；用乙醇-氨水-水（7+2+1）混合液解析 3～5 次，每次 5 mL，收集解吸液，加水定容；用 0.45 μm 濾膜過濾，待用。

1.3 色譜條件選擇

選擇甲醇及 0.02 mol/L 乙酸銨溶液 （稱取 1.54 g乙酸銨，加水至 1 000 mL，溶解，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾）作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速為 0.6 mL/min，柱溫35℃。

在190～700 nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定7種合成著色劑最大吸收波長(zhǎng)分別為：檸檬黃257.8 nm；新紅 505.3 nm；莧菜紅 216.4 nm；胭脂紅 215.2 nm；日落黃 234.1 nm；亮藍(lán) 627.5 nm；赤蘚紅 530.9 nm。由此選擇254 nm作為檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃的檢測(cè)波長(zhǎng)，530 nm作為赤蘚紅的檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm作為亮藍(lán)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

梯度洗脫條件見表1。在以上色譜條件下進(jìn)樣0.4 μL，以色譜峰面積外標(biāo)法定量，測(cè)得7種合成著色劑的色譜圖，如圖1—3所示。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)樣品各0.1 g，加水定容于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，配成1 000 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于4℃冷藏柜內(nèi)儲(chǔ)存，有效期3個(gè)月。

分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成濃度為 2.0，5.0，10，20，50 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，在 1.3 色譜條件下進(jìn)樣 0.4 μL，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution requirement

圖1 檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃出峰色譜圖Figure 1 Chromatogram of tartrazine，new red，amaranth，ponceau and sunlet yellow appearance

圖2 赤蘚紅出峰時(shí)間圖Figure 2 Appearance time of erythrosine

圖3 亮藍(lán)出峰時(shí)間圖Figure 3 Appearance time of brilliant blue

1.4 方法回收率及精密度

為考察方法的可靠性，測(cè)定7種合成著色劑進(jìn)行加標(biāo)回收率。將合成著色劑標(biāo)量為檢出限 （0.5 mg/kg，0.2 mg/kg）及 10 倍檢出限（5 mg/kg）的樣品按照1.2提取方法提取6份，計(jì)算回收率及精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及檢出限

色譜峰高為噪聲高3倍（S/N＝3）相對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表2。

從表2可以看出，7種合成著色劑在線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.2 方法回收率及精密度

通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)，對(duì)方法進(jìn)行回收率和精密度測(cè)定，結(jié)果見表3。

由表3可知：7種合成著色劑的平均回收率為91.7%～104.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.1%～3.0%（n＝6）。表明該方法精密度、準(zhǔn)確度能滿足分析要求。

3 結(jié)論

建立的UPLC法具有以下特點(diǎn)：1）分析速度快，分離7種人工合成色素僅需3 min，而文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法需12 min，毛細(xì)管電泳法需15 min。2）對(duì)于7種人工合成著色劑分離效果好。由于采用小顆粒填充的短柱，因此具有較高的柱效和較低擴(kuò)散體積。

試驗(yàn)采用梯度洗脫程序，使檸檬黃、新紅很好地分離，靈敏度也有明顯提高。使用PDA雙通道波長(zhǎng)檢測(cè)，各色素特別是亮藍(lán)的檢測(cè)靈敏度有較大提高，7種色素的檢出限為 0.2～0.5 mg/kg，回收率為 91.7%～104.1%，線性相關(guān)系數(shù) r＞0.999 5。

綜上所述，試驗(yàn)建立的使用UPLC同時(shí)檢測(cè)食品中人工合成著色劑的方法，適用于實(shí)際飲料樣品檢測(cè)工作。

表2 7種人工合成色素的線性范圍、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Liner range，linear equations，correlation coefficients and detection limit of 7 synthetic colorants

表3 7種合成色素加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 3 Mark recovery test of 7 synthetic colorants

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