復發(fā)性視神經脊髓炎患者外周血記憶T細胞與IL-7水平的變化

王金濤， 李 野， 董麗華， 隋世華， 李加梅， 鄭加平*， 周廣喜

1.山東省日照市人民醫(yī)院神經內科，日照 276800 2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經內科，天津 300052

·短篇論著·

復發(fā)性視神經脊髓炎患者外周血記憶T細胞與IL-7水平的變化

王金濤1， 李 野1， 董麗華1， 隋世華1， 李加梅1， 鄭加平1*， 周廣喜2

1.山東省日照市人民醫(yī)院神經內科，日照 276800 2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經內科，天津 300052

目的： 觀察復發(fā)與未復發(fā)視神經脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO)患者外周血記憶T細胞(CD4+CD45RA-T細胞)和IL-7水平的變化, 探討記憶T細胞在NMO復發(fā)機制中的作用。方法： 利用流式細胞儀檢測復發(fā)組(15例)、未復發(fā)組(17例)NMO患者及健康對照組(15例)CD4+CD45RA-細胞的比例。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測3組血漿白細胞介素7(IL-7)的濃度。分析32例患者的CD4+CD45RA-細胞比例與IL-7水平的相關性。結果： 復發(fā)組CD4+CD45RA-細胞比例(32.86±5.53)%高于未復發(fā)組(19.98±5.72)%及健康對照組(19.59±4.49)%，差異均有統計學意義(P<0.01)；未復發(fā)組CD4+CD45RA-細胞比例高于健康對照組，但差異無統計學意義。復發(fā)組IL-7水平[(418.73±78.96)pg/mL]高于未復發(fā)組[(313.33±57.65) pg/mL]及健康對照組[ (303.43±40.48) pg/mL]，差異均有統計學意義(P<0.01)；未復發(fā)組IL-7水平高于健康對照組，但差異無統計學意義。NMO患者CD4+CD45RA-細胞比例與IL-7的水平顯著相關(r=0.817，P=0.000)。結論： 記憶T細胞參與NMO的復發(fā)過程，而IL-7對記憶T細胞的生成和功能有促進作用

視神經脊髓炎；復發(fā)；記憶T細胞；IL-7

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO)是一種主要累及視神經及脊髓的炎性脫髓鞘疾病，臨床上以視神經和脊髓同時或相繼受累為主要特征，呈進行性發(fā)展或緩解復發(fā)交替。近年來，研究[1]發(fā)現，該病是由某些病因引起的針對水通道蛋白4產生特異性NMO-IgG抗體的自身免疫性疾病；80%～90%的患者可復發(fā)，稱為復發(fā)型視神經脊髓炎(relapsing neuromyelitis optica,RNMO)。隨著復發(fā)次數的增加，神經功能累積損傷程度越重、預后越差，故進一步探討NMO的復發(fā)機制對減少患者的復發(fā)率并改善預后有重要意義。

免疫記憶為自身免疫性疾病的重要特征。在自身免疫性疾病發(fā)病過程中，記憶T細胞(CD45RA-或CD45RO+)在抗原刺激下產生細胞因子等效應因子，并輔助B細胞產生抗體。白細胞介素7(IL-7)是維持效應T細胞生存并協助其發(fā)展至記憶階段的關鍵細胞因子[2]，尤其對維持CD4+記憶T細胞的功能起重要作用[3]。CD4+T細胞能夠分化為多種輔助性T細胞和調節(jié)性T細胞，在適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用，不僅參與體液免疫，而且參與細胞免疫。目前認為,NMO發(fā)病過程中既有體液免疫的參與，又有細胞免疫參與[4]。基于上述研究，本研究測定了NMO患者外周血記憶T細胞的變化及血清IL-7的水平，并進一步探討引起NMO復發(fā)的病理機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2015年12月在日照市人民醫(yī)院(12例)及天津醫(yī)科大學總醫(yī)院(20例)住院治療及門診就診的NMO患者。32例患者分為復發(fā)組15例、未復發(fā)組17例。另選擇15例在日照市人民醫(yī)院進行健康體檢的健康人群作為健康對照組。

1.1.1 診斷標準 患者依據Wingerchuk等[5]在2006年提出的NMO修訂后診斷標準確診。診斷標準如下：(1)視神經炎；(2)急性脊髓炎；(3)至少符合脊髓MRI T2WI圖像上超過3個脊椎節(jié)段損害征、頭顱MRI表現不符合多發(fā)性硬化、NMO-IgG血清抗體陽性3項中的2項。

1.1.2 納入標準 復發(fā)組納入標準：(1)確診NMO患者再次復發(fā)，出現新的神經系統受損癥狀或原有癥狀加重，并且癥狀持續(xù)時間大于48 h；(2)Kurtzke擴展殘疾狀態(tài)量表(Kurtzke extended disability status scale, EDSS)評分支持病情惡化；(3)不伴發(fā)熱和代謝紊亂；(4)未應用大劑量激素、免疫球蛋白或其他免疫抑制劑治療。

未復發(fā)組納入標準：(1)自上次臨床治愈后半年以上病情穩(wěn)定、無新的神經系統受損癥狀出現或原有癥狀加重；(2)EDSS評分1個月內無明顯改變。

健康對照組納入標準： (1)年齡、性別與上述兩組病例相匹配；(2)均無免疫相關疾病史，近2個月內無感染史，近3個月內未使用腎上腺皮質激素、免疫抑制劑及其他免疫調節(jié)劑等。

1.2 方 法

1.2.1 實驗試劑及儀器 人白細胞分化抗原CD4 perCP-CY 5.5、CD45RA FITC、紅細胞裂解液、FACS Calibur流式細胞儀購自BD公司；人IL-7 ELISA試劑盒購自R&D公司；標準規(guī)格酶標儀購自Thermo公司。

1.2.2 標本采集 所有研究對象于8:00～9:00采集空腹靜脈血2 mL，用EDTA抗凝。取200 μL全血，3 h內用流式細胞儀進行淋巴細胞亞型分析。余標本離心，1 006×g，收集血清，分裝后-20℃保存。

1.2.3 免疫熒光法 將上述200 μL全血分別取100 μL(白細胞約1×106個/10 μL)置入兩個空管內，分別作為試驗管及對照管。于試驗管內加入10 μL PerCP熒光標記的抗人CD4、FITC 熒光標記抗人CD45RA抗體，將試驗管與對照管放于4℃、避光10 min。染色后將試驗管和對照管在室溫下分別加入經去離子水稀釋的紅細胞裂解液(10∶1)1 mL，室溫下避光10 min。裂解后兩試管分別161×g離心5 min，棄去上清，得白細胞沉淀，加入2 mL PBS洗滌1次，161×g離心5 min。最后澄清的沉淀分別加入500 μL PBS制成單細胞懸液，上機分析。

1.2.4 酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 嚴格按照ELISA試劑盒說明書，同期檢測3組的血漿IL-7濃度。于波長450 nm 處讀取各孔光密度(D)值。以D值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，在對數坐標紙上繪制曲線圖，樣品D值對應的濃度范圍為檢測結果(血清IL-7的靈敏度為1.0 pg/mL)。

2 結 果

2.1 一般資料比較 3組資料的性別、年齡差異均無統計學意義；復發(fā)組及未復發(fā)組發(fā)病次數差異無統計學意義(表1)。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 外周血CD4+T細胞比例 熒光染色細胞標本行流式細胞術檢測，計算各組樣本外周血CD4+CD45RA-T細胞數及比例(圖1)。 復發(fā)組CD4+CD45RA-細胞比例明顯高于未復發(fā)組及健康對照組(P=0.000)；未復發(fā)組與健康對照組差異無統計學意義(表2)。

2.3 血清IL-7水平 復發(fā)組IL-7水平顯著高于未復發(fā)組及健康對照組(P<0.01);未復發(fā)組及健康對照組差異無統計學意義(表2)。

2.4 NMO患者記憶T細胞與IL-7水平的相關性分析 NMO患者記憶T細胞水平與IL-7水平正相關(r=0.817，P=0.000；圖2)。

圖1 經流式細胞儀檢測3組樣本CD4+CD45RA-T細胞數

組 別NCD4+CD45RA-細胞(%)IL-7(pg/mL)復發(fā)組1532.86±5.53*△418.73±78.96*△未復發(fā)組1719.98±5.72313.33±57.65健康對照組1519.59±4.49303.43±40.48

*P=0.000與未復發(fā)組相比；△P=0.000與健康對照組相比

圖2 NMO患者CD4+CD45RA-細胞比例與IL-7水平的相關性分析

3 討 論

人外周血T細胞主要由CD4+和CD8+T細胞所組成。根據其表型、功能和不同的組織分布，將T細胞分為多種亞群。初始T細胞是指離開胸腺但還未受到抗原刺激的T細胞。初始T細胞接受抗原刺激后轉化為效應T細胞，當抗原被清除后，90%以上的效應T細胞凋亡，5%～10%的效應T細胞轉變?yōu)橛洃汿細胞。目前，根據CD45RO 或CD45RA的表達與否鑒別初始和記憶T細胞的方法。CD45RO陰性 或CD45RA陽性為初始T細胞，反之為記憶T 細胞[6]。當再次接受抗原刺激后，記憶T細胞迅速克隆、增殖，并迅速分化為效應細胞，進而產生炎癥反應和發(fā)揮細胞毒作用。而效應T細胞轉變?yōu)橛洃汿細胞必須逃脫凋亡程序，及時獲得生存優(yōu)勢，這對記憶細胞的生成至關重要。IL-7通過上調Bcl-2和Bcl-X的表達，促進胸腺及胸腺外T細胞的增殖[5]。當IL-7少于生理需要量時，記憶T細胞的生成數量減少[7]。有文獻[8]報道，在敲除IL-7基因的小鼠中，胸腺細胞的Bcl-2表達水平大幅度下降，細胞周期停滯于G0/G1期，導致外周T細胞大量減少。本研究發(fā)現，復發(fā)組CD4+CD45RA-(即記憶T細胞)和IL-7水平較未復發(fā)組和健康對照組均顯著升高，提示NMO復發(fā)期外周血中CD4+T細胞再次受到抗原刺激后，活化和增殖狀態(tài)較好。

NMO-IgG在NMO發(fā)病過程中起重要作用。NMO-IgG來源于外周血B細胞，與星形膠質細胞足突上的水通道蛋白4(AQP4)結合成免疫復合物，通過激活補體途徑，破壞突觸細胞膜的完整性和血腦屏障功能，使郎飛節(jié)周圍和突觸微環(huán)境發(fā)生改變，導致炎癥細胞浸潤和少突膠質細胞凋亡，從而出現脫髓鞘和軸索損害[9]。血清中NMO-IgG抗體水平在復發(fā)期和緩解期含量不同，復發(fā)期含量升高，而緩解期含量下降[10]。因此，我們推測記憶T細胞再次遇到相同抗原時迅速發(fā)生克隆、增殖，并輔助B細胞增殖分化為漿細胞，產生IgG抗體，進而導致疾病的復發(fā)。IL-6、IL-17等細胞因子在NMO炎癥進展中起重要作用[11]。IL-7主要通過與T細胞、B細胞及單核細胞等細胞上的IL-7受體(IL-7R)結合發(fā)揮作用，而IL-7Rα(即CD127)可作為記憶T細胞的標志物[12]。本研究顯示，IL-7水平在急性復發(fā)期顯著增加，且與記憶T細胞相關，提示IL-7參與NMO疾病的復發(fā)，且可以作為疾病進展過程的監(jiān)測指標。

目前，NMO治療的目的是控制疾病的復發(fā)或減少復發(fā)的次數，從而延緩患者神經功能損傷的進展。雖然免疫抑制劑已廣泛應用于預防NMO復發(fā)，但NMO復發(fā)預后仍不理想。近年來，一些靶向性藥物也積極應用于臨床，如單克隆抗NMO-IgG抗體、中性粒細胞蛋白抑制劑等[13-14]。但是，記憶T細胞因其自身特性，對這些治療可能不敏感。記憶T細胞群體在體內穩(wěn)定狀態(tài)的維持主要受控于有γc亞單位的細胞因子IL-7和IL-15。有研究[15]發(fā)現，阻斷有γc亞單位的細胞因子受體能抑制記憶T細胞介導的移植胰島損傷。因此，通過阻斷IL-7與IL-7R的結合，進而減少記憶T細胞的產生可能為治療NMO提供了新途徑。

綜上所述，NMO的病因及復發(fā)的病理機制十分復雜。本研究結果提示，記憶T細胞和IL-7的異常與NMO疾病的復發(fā)有關，這為NMO的早期診斷和早期干預提供了依據。然而，由于NMO的異質性及記憶T細胞的復雜性，目前很難確定記憶T細胞水平正常與異常的臨界值，而且檢測價格昂貴，不適合廣泛應用于臨床。此外，目前沒有可靠的手段能在研究中有效地預防和控制記憶T細胞的產生。因此，仍需進一步明確記憶T細胞在臨床的應用價值，并針對記憶T細胞采取有效的治療措施。

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[本文編輯] 姬靜芳

Changes of memory T cells and IL-7 level in peripheral blood of patients with relapsing neuromyelitis optica

WANG Jin-tao1, LI Ye1, DONG Li-hua1, SUI Shi-hua1, LI Jia-mei1, ZHENG Jia-ping1*, ZHOU Guang-xi2

1.Department of Neurology, Rizhao People’s Hospital, Rizhao 276800, Shandong, China 2.Department of Neurology, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Objective： To observe the changes of memory T cells (CD4+CD45RA-T cell) and IL-7 level in peripheral blood of patients with relapsing or non-relapsing neuromyelitis optica, and discuss the role of memory T cells in NMO relapsing mechanism.Methods： The proportion of CD4+CD45RA-cells in the relapsing NMO group (n=15), the non-relapsing NMO group (n=17) and the healthy control group (n=15) was detected by flow cytometry.Plasma interleukin 7 (IL-7) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in all 3 groups.The correlation of CD4+CD45RA-cell ratio with IL-7 level in 32 patients was analyzed.Results： The CD4+CD45RA-cell ratio in the relapsing group (32.86±5.53) % was higher than that in the non-relapsing group (19.98±5.72) % and the healthy control group (19.59±4.49) %, and the differences were statistically significant (P<0.01); the ratio in the non-relapsing group was higher than that in the control group, but the difference was not statistically significant.The IL-7 level in the relapsing group([418.73±78.96] pg/mL) was higher than that in the non-relapsing group ([313.33±57.65] pg/mL) and the healthy control group ([303.43±40.48] pg/mL), and the differences were statistically significant (P<0.01); the IL-7 level in the non-relapsing group was higher than that in the healthy control group, but the difference was not statistically significant.The CD4+CD45RA-cell ratio was significantly correlated with IL-7 level in NMO patients (r=0.817,P=0.000).Conclusions： Memory T cells participate in the relapsing process of neuromyelitis optica (NMO), while IL-7 promotes the cytopoiesis and function of memory T cells.

neuromyelitis optica; relapse; memory T cells; IL-7

2016-08-15 [接受日期] 2016-11-18

王金濤, 碩士, 主治醫(yī)師.E-mail: wangjintao819@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0633-3365112, E-mail:rzzjp@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160811

R 744.5+2

A