低磷脅迫大豆RTqPCR內(nèi)參基因的篩選及谷胱丙肽合成代謝酶的表達

摘要： 谷胱丙肽在作物耐低磷中起重要作用，而選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因是保證實時熒光定量PCR（RTqPCR）結(jié)果準確的前提。該研究檢測了低磷和正常條件下兩個不同磷效率的大豆品種根葉中15個內(nèi)參基因的表達，GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt對比和RefFinder分析表明PSC、TUB和18sRNA的穩(wěn)定性最好；同時以這3個基因為內(nèi)參，檢測了不同磷脅迫時期谷胱丙肽合成代謝中兩個關(guān)鍵基因谷氨酸半胱氨酸合成酶（ γECS）和谷胱丙肽合成酶（hGSHS）的表達水平。結(jié)果表明：低磷脅迫下，磷低效品種桂香1號（GX1）根葉中γECS和hGSHS的相對表達量（Fold change， FC）都隨著脅迫時間延長而減少；磷高效品種桂夏2號（GX2）根葉γECS以及根中的hGSHS的相對表達量都隨著脅迫時間延長而增加，而葉片中hGSHS的相對表達量隨脅迫時間增加而降低。谷胱丙肽合成酶基因表達差異可能是品種磷效率差異的原因。該研究結(jié)果為大豆低磷抗性分子機理研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 大豆， 內(nèi)參基因， 實時熒光定量PCR， 谷胱丙肽合成代謝， 低磷

中圖分類號： Q945文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）08100811

Abstract： Selection of stable reference gene（s） is the prerequisite for RTqPCR analysis. Homoglutathion plays an important roles in utilization of phosphate in plants. In this study， the expression of fifteen candidate reference genes were determined in two soybean varieties differing in phosphorus efficiency under normal and stress of low phosphorus availability. Fifteen candidate reference genes were validated by GeNorm， NormFinder， BestKeeper and ΔCt comparision and RefFinder analysis， and out of those， the three most stable genes， PSC， TUB and 18sRNA， were used to normalize the expression of two genes， γglutamylcysteine synthetase （γECS） and homoglutathione synthetase（hGSHS）， involved in homoglutathion anabolism. In the low P efficient soybean variety GX1， the expression fold changes （FC， as compared to normal） of γECS and hGSHS in roots and leaves all decreased with the rise of stress duration； while in the high P efficient variety GX2， the FCs of γECS in roots and leaves， as well as hGSHS in roots increased with the increase of stress duration； except that hGSHS in leaves decreased. The results suggest that the difference of gene expression might account to the phosphorus utilization efficiency.

Key words： soybean， reference gene， homoglutathione anabolism， RTqPCR， phosphorus deficiency

實時熒光定量PCR（realtime quantitativereverse transcription PCR，RTqPCR）因具有定量準確、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量等特點，已廣泛應(yīng)用于基因的表達分析（Valasek Repa， 2005），但在RTqPCR過程中易受到RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR擴增效率等因素影響，導(dǎo)致目標基因真實表達值與實驗值間存在差異。為獲得真實可靠的實驗結(jié)果，需引入穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_量進行均一化處理，但目前未發(fā)現(xiàn)任何一個內(nèi)參基因能夠在所有實驗環(huán)境下穩(wěn)定表達，只有在特定的實驗處理下，在一定的組織和細胞中，存在某些相對恒定表達的內(nèi)參基因（Suzuki et al，2000）。如在甜櫻桃的營養(yǎng)器官中，最適合的內(nèi)參基因為CYP2，而在生殖器官中，最適合的內(nèi)參為SAND2（張芳明，2013）；吝愛月（2012）對玉米的研究顯示，CYP是低溫和鋁毒脅迫下穩(wěn)定性最強的內(nèi)參基因；EFlα是高溫和鹽脅迫下最合適的內(nèi)參基因；TUB是干旱脅迫下最合適的內(nèi)參基因等；還有針對茶樹（Hu et al，2009）、菠蘿蜜（汪永保等，2014）、芝麻（劉莉銘等，2012）等植物內(nèi)參基因的篩選，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果也不盡相同。由于內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在差異，研究者需根據(jù)自己的實驗要求來篩選相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

大豆（Glycine max， soybean）是我國主要的油料作物，是全人類最主要植物性蛋白質(zhì)的來源之一，在醫(yī)學、工業(yè)生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)方面也有很大價值。南方土壤中的磷易與鋁形成沉淀，大豆不能有效吸收磷元素，缺磷成為了南方地區(qū)影響大豆產(chǎn)量主要問題之一。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種抗氧化劑，通過AsadaHalliwell途徑清除活性氧、保護植物體內(nèi)生物大分子的巰基（SH） 在生物體內(nèi)能保護DNA、蛋白質(zhì)和其他生物分子抵抗氧化損傷，其在生物體抵抗各種脅迫（冷害、干旱、重金屬、真菌等）的過程中起重要作用（Lxppartient et a1，1999）。大豆中谷胱丙肽（homoglutathione，hGSH）幾乎具有GSH的全部功能（Hopkins，1929）。hGSH的生物合成分兩步完成，首先γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γglutamylcysteine synthetase， γECS）催化L谷氨酸和L半胱氨酸下合成γ谷氨酸半胱氨酸（γglutamylcysteine， γEC）；然后在谷胱丙肽合成酶（homoglutathione synthetase， GSHS）的催化下，丙氨酸被添加在γ谷氨酸半胱氨酸C末端生成hGSH。γECS和hGSHS被認為是GSH生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其含量水平的高低與植物對各種環(huán)境脅迫的忍耐程度有關(guān)。γECS和hGSHS是由γECS和hGSHS獨立進化的，γECS可能起源于藍細菌，hGSHS 出現(xiàn)后，真核細胞和大多細菌才分別獨立的進化獲得hGSHS（Copley Dhillon，2002）。擬南芥GSHS序列與其它真核生物的cDNAs具有很高的序列同源性，而γECS序列卻有很大差異（May，1994）。γECS和hGSHS的表達量高低與植物抗逆性有密切相關(guān)。

目前，尚未見有對大豆低磷脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性的相關(guān)報道。本研究旨在探討大豆在低磷脅迫下相關(guān)15個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，根據(jù)內(nèi)參基因的篩選結(jié)果，用于研究低磷脅迫下谷胱丙肽合成代謝過程中的γECS和hGSHS的兩個關(guān)鍵基因的表達水平，為大豆低磷抗性分子機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料和脅迫處理

以大豆磷低效品種桂香1號（簡稱GX1）和磷高效品種桂夏2號（簡稱GX2）為材料， 大豆由廣西農(nóng)業(yè)科學研究院經(jīng)濟作物研究所提供。

挑選飽和度相當?shù)姆N子，使用30%的H2O2消毒

浸泡1 min，轉(zhuǎn)入飽和的CaSO4中浸泡30 min，放入濕潤的沙子中培養(yǎng)，待第一片復(fù)葉長出后，移栽到1/5 Hoagland營養(yǎng)液中水培。培養(yǎng)期間實驗組進行低磷（1/5Hoagland營養(yǎng)液，其中KH2PO4終濃度為0.2 μmol·L1，pH=4.5）和對照處理（1/5 Hoagland營養(yǎng)液，pH=4.5），2 d換1次營養(yǎng)液，每小時通氣10 min，每天的8：00和18：00各調(diào)節(jié)1次pH（李艷英等，2012），收集脅迫處理2、4、8、12、16 d的大豆根尖和葉片樣品，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取按照植物RNA提取試劑盒（北京康為世紀）操作說明進行，RNA提取結(jié)果用凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測其濃度和純度，當28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，A260/A280的值在1.8～2.2之間，A260/A230在2.0以上，則用于后續(xù)實驗；逆轉(zhuǎn)錄按參照反轉(zhuǎn)錄酶（Takara，大連）說明書合成cDNA第一鏈，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)參基因和目的基因引物的設(shè)計和合成

于NCBI查找出15個內(nèi)參基因18sRNA、ACT、ATP、CYP、EFlα、EFlβ、G6PDH、PE、PP2A、PSC、TIF、TUB、UNK1、UNK2、Letin序列，用Primer3.0軟件設(shè)計引物，引物合成交由上海生工公司完成，引物序列見表1。

1.4 內(nèi)參基因RTqPCR體系

采用BioRAD CFX96定量PCR儀，2×SYBR Green mix（北京康為世紀）試劑進行內(nèi)參基因RTqPCR。10 μL體系，含2 × SYBR mix 5 μL；上、下游引物各0.5 μL；cDNA 0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。RTqPCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；65 ℃/60 ℃ 30 s；40個循環(huán)；65～95 ℃生成熔解曲線，每升高0.5 ℃保持5 s，4個生物學重復(fù)，當基因的溶解峰為單一峰，無雜峰，無二聚體，擴增曲線重復(fù)性良好，則進行后續(xù)實驗。

1.5 內(nèi)參基因引物擴增效率的計算

取樣品cDNA，以10倍稀釋為6個梯度，濃度由100遞減至105。cDNA的稀釋梯度作橫坐標，檢測到的Ct值作為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)公式E=（101/slope-1）×100%來計算擴增效率，待內(nèi)參基因的E的值在90%～110%，R2>0.99時，即可往下實驗，引物擴增效率如表1。

1.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析

取各個樣品進行RTqPCR，收集檢測到的每個樣品Ct，用excel處理數(shù)據(jù)。以Genorm （Vandesompele et al， 2002）、NormFinder （Andersen et al， 2004）、BestKeeper （Pfaffl et al， 2004）和ΔC對比 （Silver et al， 2006）來分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，最后用RefFinder（Xie，2012）綜合評價篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。GeNorm和NormFider程序需要將Ct值轉(zhuǎn)化成Q值才能進行分數(shù)據(jù)分析，轉(zhuǎn)化公式為Q=ECt sample-Ct min（E為擴增效率，當擴增效率接近100%時，E通常默認為2。Ct sample為該基因在樣品中的Ct值，Ct min為該基因在樣品中的最小Ct值）。

1.7 γECS和hGSHS合成及檢測

實驗擴增γECS和hGSHS的基因片段，引物設(shè)計（hGSHS，F(xiàn)： ACAACACCACCTTTCCCTT，R：ATCAGCAGCAGCCTCTTCA，Genbank：NM001250121.1；γECS，F(xiàn)：CCTTGTCCGTCCAGTCCTTATT，R：TCAGTGGCAACTACAGCGTCTT，Genbank：XM006580527.2）、合成、擴增效率計算方法同內(nèi)參基因。最后以DL2000 Marker為標記，1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，選取與預(yù)期大小一致條帶用瓊脂糖膠回收試劑盒（Takara，大連）回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18T載體（Takara，大連），轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細胞，涂抹于含Amp/IPTG/XGal的平板上，進行藍白斑篩選，測序交由上海生工公司完成，測序結(jié)果無誤后，進行熒光定量PCR，定量數(shù)據(jù)采用 2-△△Ct 法（Livak Schmittgen，2001）計算基因的相對表達量。

2結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因熒光定量PCR結(jié)果

以大豆不同材料來源的第1鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳證實，在80～250 bp之間均存在較亮的特異條帶， 與引物設(shè)計的預(yù)期片段大小一致，說明擴增反應(yīng)具有較高的專一性，為內(nèi)參基因的目標片段，如圖1所示。

2.2 Ct的可靠性分析

根據(jù)RTqPCR得到的Ct值可比較基因表達的豐度。Ct值越高，表明該基因表達的mRNA含量就越低，反之，則mRNA含量越高。結(jié)果如圖2所示，15個內(nèi)參基因在40個樣本中的平均Ct值在15～35之間，主要集中在20～30之間，每個基因在樣品中存在不同范圍的波動，從圖2可以看出分布范圍最大的基因是ACT，Ct值差值達到15.84。CYP的Ct值分布最集中，在所有樣本中18s rRNA所有樣本中的的Ct值最低，說明它們的mRNA量在樣本含量最高。

2.3 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.3.1 使用GeNorm軟件的分析方法GeNorm（Vandesompele et al， 2002）軟件通過表達穩(wěn)定指數(shù)M來確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，M值越大，基因的穩(wěn)定性越低，反之則越高，M=1.5為上限，M<1.5判斷為相對穩(wěn)定。GeNorm軟件計算結(jié)果如圖3所示，候選內(nèi)參基因M值的排序為PSC=PP2A

Genorm除了對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行排序外，該程序還能對候選的內(nèi)參基因標準化因子的配對差異V（Vn/n+1）進行分析，從而確定最合適的內(nèi)參基因數(shù)目。該程序默認的V值是0.15，若Vn/n+1>0.15，則有必要引入下一個內(nèi)參基因，若Vn+1/n+2<0.15，則在該實驗條件下合適的內(nèi)參基因數(shù)目是n+1個。但若V值都大于0.15，標準化因子無法得出最優(yōu)的內(nèi)參基因數(shù)目，可直接選取3個最穩(wěn)定的內(nèi)參基因用于矯正目的基因。根據(jù)本研究結(jié)果，V值都大于0.15， 所以以3個內(nèi)參基因作為最合適的內(nèi)參基因數(shù)目，詳見圖4。

2.3.2 使用NormFinder軟件的分析方法NormFinder（Andersen et al，2004）程序用Excel軟件計算基因的穩(wěn)定S，S值越低，則該基因越穩(wěn)定，反之不穩(wěn)定。如圖5所示，15個候選的內(nèi)參基因在所有的樣品中，S的排序為PSC

2.3.3 BestKeeper軟件分析法BestKeeper（Pfaffl et al，2004）程序以每個基因的4次平均數(shù)為原始數(shù)據(jù)，對每個基因在樣品中產(chǎn)生的標準偏差（SD）與變異系數(shù)（CV）來分析內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性，SD越小，CV越小，基因表達越穩(wěn)定，以SD=1.0為界限，若SD值大于1.0，則認為基因在樣品中的表達是不穩(wěn)定的，再根據(jù)CV進行排名得出穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在全部樣品中，除了UNK1的SD值為0.87外，其余的SD值都大于1， 因此除UNK1外， 其余的內(nèi)參基因都判定為不穩(wěn)定的；同時，UNK1的CV值在有的基因中最小。因此，根據(jù)BestKeeper的結(jié)果顯示，認為UNK1是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，詳見表2。

2.3.4 使用ΔCt值對比分析法ΔCt值分析法（Silver et al，2006）是對兩個基因在所有的樣本中進行兩兩比較，計算兩個基因之間的ΔCt，若ΔCt值在樣本中波動很大，說明至少有一個基因在所有樣品中是不穩(wěn)定表達的，此時引入下個基因來進行兩兩比較，最終比較每兩個基因的ΔCt的平均標準偏差（Mean StdDev），Mean StdDev越小即表示該基因在相對其他基因變化越小，該基因則越穩(wěn)定。如表3所示，15

個候選內(nèi)參基因在所有樣品中Mean StdDev最小的是ATP，則穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因為ATP，穩(wěn)定性差的是為CYP因其Mean StdDev最大。

2.3.5 使用RefFinder軟件結(jié)果分析如表4所示，每種軟件分析得到的內(nèi)參基因排序具有一定的相似性和差異性，此時則需要RefFinder（Xie，2012）軟件作出綜合評價，RefFinder軟件根據(jù)候選內(nèi)參基因在每種分析軟件中的排序予以一定權(quán)重后，計算出其排序的幾何平均值，內(nèi)參基因的幾何平均值越小，圖 6γECS 和hGSHS基因比對結(jié)果 A. γECS比對結(jié)果； B. hGSHS比對結(jié)果。

Fig. 6Blast results of γECS and hGSHS A. Blast result of γECS； B. Blast result of hGSHS.

說明該內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好。排名結(jié)果顯示，排在前三位的是PSC、TUB和18sRNA，則判斷這三個基因是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因，而穩(wěn)定性最不好的是PE。結(jié)合GeNorm軟件分析，本研究選用3個內(nèi)參作為最佳的內(nèi)參基因數(shù)目，因此，在低磷脅迫下，最合適的內(nèi)參基因為PSC、TUB、18sRNA。

2.4 hGSHS、γECS基因序列比對結(jié)果

如圖6所示，序列經(jīng)Blast分析后表明，相似度均符合要求，各引物擴增出的片段均為目標基因，可用于后續(xù)實驗。

2.5 γECS和hGSHS熒光定量PCR結(jié)果

2.5.1 γECS熒光定量PCR分析 圖7和圖8顯示，CK為正常條件下2 d時根和葉部樣品。在GX1的根部中，γECS的相對表達量隨脅迫時間的增加，出現(xiàn)了先增加后減少的趨勢，在葉部，在受到低磷脅迫2 d，12 d時，其表達量均在CK以下，呈減少趨勢；GX2中，無論是根部還是葉部，其相對表達量都現(xiàn)增加趨勢，其中屬葉部漲幅最大，在12 d時其增長了CK的12.008倍；另外，標準偏差的大小反應(yīng)了不同內(nèi)參基因矯正后目的基因相對表達量的離散程度，出現(xiàn)了在某些時期矯正結(jié)果差異較大的現(xiàn)象，說明不同的內(nèi)參基因矯正是有一定差異的。

2.5.2 hGSHS熒光定量PCR結(jié)果CK為正常條件下2 d時根和葉部樣品。與CK相比，hGSHS在GX1中相對表達量無論在根部還是葉部隨脅迫時間增加均呈現(xiàn)減少趨勢，在12 d時減少最甚，相對表達量在0.1左右。在GX2的根部，hGSHS的相對表達量在2 d時比CK組少，但在12 d時其相對表達量達到CK的4.490倍；而其葉部，2 d時其表達量增加了CK的5.271倍，達最大值，卻在12 d的時候含量減少為CK的1.561倍，因此，在磷高效品種中，hGSHS的相對表達量在根部呈現(xiàn)隨時間增加先減少后增加的趨勢，而在葉部相反，如圖9、圖10所示。

3討論

3.1 內(nèi)參基因篩選

隨著RTqPCR的廣泛應(yīng)用，內(nèi)參基因的篩選越來越受到人們的重視。理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件：（1）在不同類型的細胞和組織中及不同生長發(fā)育階段都穩(wěn)定表達；（2）表達不受環(huán)境、生物或非生物脅迫等內(nèi)源性和外源性因素的影響；（3）不存在假基因，以避免基因組DNA擴增；（4）其穩(wěn)定表達量與目的基因表達量近似（Vandesompele et al，2002），常用的有Actin、18s rRNA和G6PDH等管家基因。本研究評價了15個常見的管家基因，分析它們在不同的品種（GX1和GX2），不同部位（根和葉），不同時期（2、4、8、12、16 d），共40個樣品中的穩(wěn)定性，選用4種方法進行評價，發(fā)現(xiàn)使用不同的評價軟件時，其結(jié)果也存在一定的差異和相似，如PSC在GeNorm和NormFinder軟件中排名第1，在BestKeeper軟件排名第5，而在△Ct分析法排到第13位；PE在GeNorm和BestKeeper軟件中排名第14位，在NormFinder軟件排到15名，△Ct分析法排在11位，之前有研究者在使用不同的軟件分析，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名基本一致，當然也存在排名不一致的情況（Andersen et al，2004），分析認為不同分析軟件評價內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的運算方式不同，因此每個軟件的計算結(jié)果可能會存在一定出入，此時，需要引入RefFinder將4種分析方法的計算結(jié)果進行綜合評價，得出相對準確的結(jié)果，這也是被證明是可行的（Zsori et al，2013）。

RefFinder結(jié)果顯示，PSC、TUB、18sRNA這3個基因是15個候選的內(nèi)參基因中穩(wěn)定性最好的基因。楊樹根在不同時期中發(fā)育的Eflɑ和18srRNA表達穩(wěn)定（Xu et al，2011）；水稻在紫外線傷害下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是18srRNA（Kim et al，2003）；菠蘿蜜中18sRNA是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一（汪永保等，2014），這與本研究結(jié)果有一定相似性，認為18sRNA為核糖體RNA，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體，其功能是作為mRNA的支架，參與蛋白質(zhì)的合成，在細胞生長中起到不可或缺的作用，植物通過過量且穩(wěn)定表達18sRNA來維持正常的細胞活動。因此，18sRNA相對其他管家基因中表達豐度最大，且穩(wěn)定性良好。TUB是細胞內(nèi)編碼微管蛋白的基因（Yoshikawa et al，2003），只有TUB在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達，才能保證細胞基礎(chǔ)活動的順利進行。蘋果在不同時期、不同組織、不同基因型中和玉米在干旱環(huán)境下TUB的穩(wěn)定性最佳（吝愛月，2012）；而本研究中，TUB的穩(wěn)定性亦排到第二。PSC用于編碼絲氨酸羧肽酶的基因之一，絲氨酸羧肽酶參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個重要環(huán)節(jié)，是植物生長繁殖中的重要物質(zhì)，PSC是15個候選的內(nèi)參基因中穩(wěn)定性最良好的內(nèi)參基因。大豆在受到不同的光周期下，穩(wěn)定性最好的是ACT11，UKN1和UKN2（Hu et al，2009），大豆在鹽脅迫下Eflɑ和 ACT11表達穩(wěn)定；TUB4、TUA5和Eflɑ在干旱處理時穩(wěn)定；ACT11和 UKN2在黑暗（衰老）處理時穩(wěn)定；而Eflβ和UKN2在受大豆花葉病毒侵染時表達穩(wěn)定（馬淑華，2013）；這與本研究在缺磷脅迫的結(jié)果不同，進一步說明內(nèi)參基因在不同實驗環(huán)境下表達穩(wěn)定性存在差異，研究者在實驗前先篩選合適的內(nèi)參基因，否則可能會導(dǎo)致定量結(jié)果不準確。

3.2 γECS和GSHS表達分析

磷調(diào)控植物體內(nèi)線粒體的氧化磷酸化、電子傳遞鏈、葉綠體的能量傳遞、光合磷酸化過程，是植物體內(nèi)不可缺少的元素之一。植物缺磷可使ATP的合成受到影響，電子傳遞與磷酸的解偶聯(lián)，能量經(jīng)還原氧氣產(chǎn)生自由基從而被消耗掉（曹黎明和潘曉華，2000）。過多的自由基易對植物的生理活動造成影響，谷胱丙肽能有效清除植物體內(nèi)自由基。大豆在低磷和鋁毒脅迫下，大豆中的hGSH含量明顯提高，且磷高效品種中hGSH上升的幅度要大于磷低效品種（李艷英等，2012）。Verena et al（2010）報道在煙草中過量表達γECS，葉片中GSH含量提高20至30倍；在轉(zhuǎn)基因楊樹中，γECS的過量表達增加了GSH含量（Arisi et al，1997）；在重金屬脅迫下，油菜GSHS和γECS基因表達增加；印度芥菜中分別過量表達GSHS，增加了植物對Cd 的耐性（Grill et al，1985）?？梢?，在許多逆境脅迫下，推測植物可能通過增加hGSHS、γECS的表達量，從而增加谷胱甘肽的合成來抵抗逆境脅迫。本研究低磷處理下發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽的合成酶基因γECS和hGSHS在磷低效和磷高效兩個大豆品種中均有表達，但其表達具有一定的差異性。隨著脅迫時間的增加，磷低效品種γECS和hGSHS相對表達量隨脅迫時間增加而逐漸減少，說明低磷脅迫影響了谷胱甘肽的合成代謝中γECS和hGSHS的表達；而在磷高效品種中，γECS在根葉部和hGSHS在根部的相對表達量都隨脅迫事件延長而增加，分析推測GX2根部通過增加的hGSHS和γECS的相對表達量，從而合成更多的hGSH來抗低磷脅迫，但因葉部hGSHS含量降低，推測根部比葉部具有更強的耐性。

4結(jié)論

在15個內(nèi)參基因中，18sRNA、TUB、PSC穩(wěn)定性最佳，這是基于5種分析軟件的結(jié)果，用于研究低磷脅迫下熒光定量分析可得到相對可靠的結(jié)果，但是隨著研究的深入，不排除能找到更合適的內(nèi)參基因；低磷脅迫下，不同磷效率品種的大豆γECS和hGSHS的相對表達量在不同時期，不同部位具有一定的表達差異，磷高效品種在低磷脅迫下能有效誘導(dǎo)大豆γECS和hGSHS的增量表達，而磷低效品種表達量減少。因此，認為谷胱丙肽合成酶基因表達差異可能是品種磷效率差異的原因。

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