擬南芥At1g10300基因調(diào)節(jié)葉形和開花時間

摘要： 核仁G蛋白1（Nucleolar G protein 1， NOG1）是一種高度保守的核仁GTP酶，在真核生物中廣泛存在，參與60 S核糖體亞基前體的組裝。在線蟲中敲減NOG1的表達造成生長緩慢、蟲體變小和壽命延長的表型，而過量表達NOG1則使線蟲的壽命縮短。擬南芥的At1g10300基因注釋為NOG12，但是其生物學功能還有待研究。該研究對其功能進行了初步研究，首先檢測了該基因在擬南芥各個器官的表達情況。結果表明：該基因在7 d齡幼苗、莖生葉和花中均有表達，其中在花中表達量最高。獲得了At1g10300基因的TDNA插入突變體，發(fā)現(xiàn)在長日照條件下，At1g10300突變體植株的蓮座緊湊，蓮座葉片長寬比降低，但葉面積和植株高度與野生型相比無顯著差異，表明其葉形發(fā)生改變；突變體植株的抽薹時間晚于野生型。熒光定量RTPCR結果表明，突變體植株中開花促進因子FT、CO和GI的表達水平下調(diào)，而開花抑制因子FLC的表達水平上調(diào)。以上結果揭示At1g10300基因的突變影響了FT、CO、GI及FLC基因的表達，使植株出現(xiàn)晚花表型。

關鍵詞： 擬南芥， 核仁G蛋白1， At1g10300基因， 開花時間， 葉形

中圖分類號： Q945.4文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）08100008

Abstract： Nucleolar G protein 1 （NOG1） is a highly conserved eukaryotic GTPase. NOG1 plays a significant role in the assembly of pre60S ribosomal subunits. In yeast and animals， depletion of NOG1 results in reduced levels of 60S ribosomal subunits， aberrant prerRNA processing， and blockage of 60S ribosomal subunit export. A recent study in Caenorhabditis elegans found that knockdown NOG1 expression causes slower growth， smaller body size and increased life span， whereas overexpression of NOG1 results in decreased lifespan. However， the plant NOG1 has not been characterized. The Arabidopsis At1g10300 gene was annotated as NOG1-2. However， its role in Arabidopsis growth and development is still unknown. In this study， we used physiological， genetics and molecular tools to analyze the biological roles of the Arabidopsis At1g10300 gene. We firstly used semiquantitative RTPCR to investigate the transcriptional levels of At1g10300 gene in various tissues of Arabidopsis， including 7dayold seedling， rosette leaf， cauline leaf， stem， bud and flower. The transcription of the At1g10300 gene was detected in seedlings， cauline leaves and blooming flowers. Among them， the highest transcriptional level was detected in blooming flowers. We then isolated a TDNA insertion mutant allele of the At1g10300 gene. Phenotypic analysis found that the At1g10300 mutant had compact rosette and reduced ratio of leaf length/width compared to wild type. However， there was no significant difference in leaf area or plant height between the At1g10300 mutant and wild type. These data indicated that leaf morphology of At1g10300 mutant was altered. The At1g10300 mutant also displayed a late bolting phenotype under the condition of longday photoperiod. To determine the molecular mechanism of this late flowering phenotype， we used quantitative RTPCR to analyze the transcriptional levels of key genes of the flowering time pathway， including FLOWERING LOCUS T （FT）， CONSTANS （CO）， GIGANTEA （GI） and FLOWERING LOCUS C （FLC）. The results showed that the transcriptional levels of the flowering promoting factors FT， CO and GI were downregulated in the mutant plants compared with the wild type， whereas the transcription levels of the flowering inhibiting factor FLC was upregulated. Taken together， these results suggest that mutation of At1g10300 gene delays flowering time by regulating the expressions of FT， CO， GI and FLC genes in Arabidopsis. Our data indicate that like its ortholog in worms， lossoffunction of At1g10300 gene also affects Arabidopsis rosette size and lifespan.

Key words： Arabidopsis， nucleolar G protein 1 （NOG1）， At1g10300 gene， flowering time， leaf morphology

小G蛋白是一類通過結合并水解鳥嘌呤5′三磷酸（GTP）成為鳥嘌呤5′二磷酸（GDP）從而將細胞信號傳遞到下游因子的蛋白（Bourne et al，1991）。小G蛋白參與調(diào)控細胞生命活動的各個方面，包括細胞增殖、囊泡運輸、微管骨架的組裝和核糖體的生成。核仁G蛋白1（Nucleolar G protein1， NOG1）是一種高度保守的核仁GTP酶，在真核生物中廣泛存在，參與60S核糖體亞基前體的組裝 （Park et al，2001；Jensen et al，2003；Kallstrom et al，2003）。在線蟲中敲減NOG1的表達造成生長緩慢、蟲體變小和壽命延長的表型，而過量表達NOG1則使線蟲的壽命縮短（Kim et al，2014）。Wu et al（2016）對60S核糖體亞基前體的結構解析發(fā)現(xiàn)，NOG1與多個組裝蛋白和核糖體RNA相互作用，是60S核糖體亞基組裝和運輸?shù)胶送獾闹匾?。目前關于植物NOG1同源基因的研究報道相對較少。擬南芥中存在At1g50920和At1g10300兩個NOG1的同源基因，分別注釋為NOG11和NOG12，二者編碼的蛋白均定位于細胞核中（Suwastika et al，2014）。但其是否具有與酵母和線蟲NOG1蛋白類似的功能以及在植物生長發(fā)育中的作用還有待研究。擬南芥基因表達數(shù)據(jù)庫的資料顯示At1g10300基因在花中表達水平較其他組織高，故推測其可能與植物的開花相關。Heo et al（2012）研究表明，鈣離子依賴的G蛋白XLG2 （Extralarge G Protein 2， XLG2）可以促進開花整合因子FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1/AGL20 （SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）的表達，促使擬南芥提早開花。

擬南芥的開花時間受許多內(nèi)部和外部因素的調(diào)控，可歸為4個基本途徑，即光周期途徑（photoperiod pathway）、自主途徑 （autonomous pathway）、春化途徑（vernalization pathway） 和赤霉素途徑（GA pathway）（Mouradov et al，2002； Simpson Dean，2002）。一般認為有兩個基因在這些促進開花途徑的下游起作用，其中一個是CONSTANS（CO）基因，另一個是FLOWERING LOCUS C（FLC）基因（李昱等，2007）。CO為光周期途徑下游的主要調(diào)控因子，也是生物鐘調(diào)節(jié)途徑的關鍵基因，該基因編碼具有兩個Bbox類型鋅指結構的GATA轉錄因子，其C端有CTT域（Putterill et al，1995； SuárezLópez et al，2001； 張素芝和左建儒，2006）。GI基因也屬于光周期途經(jīng)中，是獨立于CO通過miR172來調(diào)節(jié)開花的（Jung et al，2007）。FLC編碼一個含MADS結構域的轉錄因子，是開花抑制因子。自主途徑和春化作用都是通過抑制FLC的表達促進開花的。因此，F(xiàn)LC是自主途徑和春化途徑的調(diào)節(jié)節(jié)點（Michaels Amasino，2001）。而成花素基因FT在調(diào)控開花時間途徑的下游起整合因子的作用（Samach et al，2000）。

為了研究At1g10300基因的功能，我們通過半定量RTPCR測定了該基因在擬南芥各個組織器官的表達情況，并獲得了該基因的純合突變體，對其表型進行觀察及定量分析，并運用熒光定量RTPCR測定了突變體中調(diào)控開花時間的關鍵基因CO、FLC、FT等的表達情況，為進一步研究At1g10300基因在植物開花方面的調(diào)控機制奠定了基礎。

1材料與方法

1.1 材料

選用擬南芥哥倫比亞（Columbia， Col0）生態(tài)型作為研究材料。At1g10300基因的TDNA插入突變體SALK_043706訂購自ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）擬南芥種子庫。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng)消毒：將擬南芥種子倒入1.5 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇消毒，顛倒混勻5 min后吸出液體；再用1 mL 1%的次氯酸鈉消毒，顛倒混勻10 min；吸出次氯酸鈉，用無菌蒸餾水沖洗種子4～5次，最后加入1 mL無菌蒸餾水。為使種子萌發(fā)整齊，放入4 ℃冰箱中，低溫處理3 d。然后均勻鋪在MS固體培養(yǎng)基表面，在植物光照培養(yǎng)箱中豎直放置。待培養(yǎng)至7 d，將幼苗移到土中，在光周期為16 h光/8 h暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.2 擬南芥DNA的提取在1.5 mL的離心管中加入400 μL DNA提取緩沖液（0.2 mol·L1 TrisHCl、0.25 mol·L1 NaCl、0.5% SDS、0.025 mol·L1 EDTA），取約1 cm2的擬南芥葉片（3～4周齡植株）放入上述DNA提取緩沖液中，用研磨棒將葉片研碎成勻漿。之后14 000 r·min1離心10 min，用移液槍吸取200 μL上清轉移到新管中，加入400 μL無水乙醇，顛倒混勻。10 000 r·min1離心1 min，倒掉上清，沉淀于室溫下晾干。最后加入50～100 μL無菌水溶解DNA。提取到的擬南芥基因組DNA可在4 ℃條件下保存至少1個月。

1.2.3 總RNA的提取和cDNA的合成分別采集野生型擬南芥的7 d齡幼苗、蓮座葉、莖生葉、莖的第二節(jié)間、花苞和盛開的花用于At1g10300基因表達模式的分析。采集24 d苗齡的野生型和突變體植株的蓮座葉用于突變體植株的轉錄水平分析。分別取約100 mg植物材料，用“酸性酚-硫氰酸胍-酚氯仿提取法”提取總RNA，對得到的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量；對粗提后的RNA進行DNAase I消化并除去多糖、蛋白質等成分，用瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的RNA的質量。用反轉錄試劑盒對2 μg總RNA進行反轉錄，在PCR儀中42 ℃反應30 min，85 ℃保溫5 min使酶失活，即合成cDNA。

1.2.4 半定量RTPCR分析采用反轉錄后合成的cDNA，通過PCR檢測At1g10300基因的轉錄水平，并選用ACTIN2基因作為內(nèi)參。反應程序：預變性 94 ℃ 5 min； 變性94 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。共進行3次實驗重復。

1.2.5 熒光定量RTPCR分析以24 d苗齡的野生型和突變體植株的蓮座葉的總RNA反轉錄得到的cDNA作模板，以ACTIN2基因為內(nèi)參，進行定量 PCR反應。采用Primer Premier 5.0軟件設計At1g10300基因的特異引物作為擴增引物。擴增程序如下：預變性94 ℃ 2 min； 變性94 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸 72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。3次實驗重復。

2結果與分析

2.1 At1g10300基因的表達模式

為了探究At1g10300基因在擬南芥中的時空表達模式，我們?nèi)∫吧蛿M南芥的7 d齡幼苗、蓮座葉、莖生葉、第二節(jié)間莖、花苞和盛開的花作為材料，提取其總RNA并反轉錄獲得cDNA，通過RTPCR來檢測擬南芥不同組織中At1g10300基因的表達水平。結果顯示At1g10300基因在成熟的花中表達量最高，在7 d幼苗和莖生葉中也有一定的表達（圖1）。這暗示著At1g10300基因對擬南芥的開花有一定作用。

2.3 At1g10300突變體葉形改變

對At1g10300基因突變體植株的生長發(fā)育情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，At1g10300突變體植株蓮座形態(tài)較緊湊（圖3：A），測量結果也表明其蓮座直徑顯著小于野生型（圖3：B）。為探究產(chǎn)生這一表型的原因，首先測量了植株的葉柄長度，發(fā)現(xiàn)At1g10300突變體植株與野生型的葉柄長度無顯著差異（圖3：C）。接下來測量了葉片長度和葉片寬度，結果顯示At1g10300突變體植株的葉片長度比野生型小0.4～0.7 cm（圖3：D），且差異極顯著（P<0.01），葉片寬度比野生型多0.3～0.5 cm（圖3：E），且差異極顯著（P<0.01），計算得出At1g10300突變體植株與野生型相比葉片長寬比顯著降低（P < 0.01）（圖3：F）。而經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)，雖然突變體植株葉片長度和寬度發(fā)生變化，但其葉面積與野生型相比并無顯著差異（圖3：G），植株高度（圖3：H）也無顯著變化。以上結果表明，At1g10300突變體特異地影響了葉片的形態(tài)，使葉片長度縮短，寬度變寬，造成蓮座緊湊的表型。

2.4 At1g10300突變體開花延遲

觀察發(fā)現(xiàn)At1g10300突變體植株開花明顯晚于野生型（圖4：A）。擬南芥植株在營養(yǎng)生長過程中蓮座葉持續(xù)成對出現(xiàn)直至其轉變?yōu)樯成L，而植株的抽薹正是其由營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L的重要節(jié)點，因此為了準確衡量野生型與At1g10300突變體植株的開花時間，選取植株抽薹時間以及植株抽薹時的葉片數(shù)來進行統(tǒng)計。結果顯示At1g10300突變體植株比野生型植株抽薹時間晚3～5 d （圖4：B），開花時突變體蓮座葉片數(shù)比野生型多7～10片（圖4：C）。以上結果表明，At1g10300突變體植株出現(xiàn)明顯的開花延遲的表型。

2.5 At1g10300突變體植株中開花時間相關基因的表達量改變

基于上述表型觀察及統(tǒng)計結果，對于At1g10300突變體植株開花推遲的分子機制開展進一步探究。首先選擇控制植物由營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L的關鍵基因FT，測定其在野生型及突變體中的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)在At1g10300突變體植株中FT基因的相對表達量比野生型降低了一倍多（圖5：A）。接下來測定了控制開花時間的正調(diào)節(jié)基因CO、GI以及負調(diào)節(jié)基因FLC的轉錄情況，結果表明在At1g10300突變體植株中CO及GI基因的相對表達量比野生型降低50%左右（圖5：BC）；而突變體中開花時間負調(diào)節(jié)因子FLC的相對表達量則比野生型提高20多倍（圖5：D）。因此，At1g10300基因突變使開花時間正調(diào)節(jié)基因FT CO和GI的轉錄水平降低， 使開花抑制基因FLC的表達上調(diào)， 造成突變體植株晚花的表型。

3討論

本研究通過植物生理學、遺傳學和分子生物學手段初步分析了擬南芥注釋為編碼NOG1的At1g10300基因的功能。對At1g10300突變體植株的表型觀察表明，突變體開花延遲，并檢測了At1g10300突變體植株中CO、GI、FLC和FT基因的相對表達情況。本研究結果表明，由于At1g10300基因功能的缺失，導致CO和GI基因表達量降低，F(xiàn)LC基因表達量升高，進而影響FT基因表達量降低，最終導致突變體植株的晚花表型。但是，At1g10300基因是如何調(diào)節(jié)這些開花時間相關基因的表達還有待進一步研究。線蟲中的研究發(fā)現(xiàn)，NOG1基因可通過胰島素信號通路調(diào)節(jié)線蟲的脂肪積累、生長速率和壽命長短（Kim et al， 2014）。擬南芥At1g10300基因是否通過某種信號通路調(diào)節(jié)開花基因的表達還有待后續(xù)的研究。

At1g10300突變體蓮座葉形態(tài)發(fā)生改變，與野生型相比突變體蓮座葉片變短、變寬，但葉面積無顯著差異。葉在空間三維軸向上的極性包括第一維軸向是基—頂軸（proximaldistal axis），基部靠近莖頂端分生組織分化出葉柄，遠離莖頂端分生組織分化出葉片。第二個軸向是中—側軸（mediallateral axis），沿著葉的中脈向葉的邊緣水平擴展的方向。第三個軸向是近—遠軸（adaxialabaxial axis），也稱背—腹軸（dorsalventral axis），葉原基靠近莖頂端分生組織的一側稱為近軸面（背面），遠離莖頂端分生組織的一側稱為遠軸面（腹面）。本研究中，At1g10300突變體植株的基—頂軸分化顯著縮短，中—側軸分化顯著增加，長寬比顯著縮短。擬南芥的葉沿基—頂軸分化會產(chǎn)生基部的葉柄和頂部的葉片，ROTUNDIFOLIA3/4（ROT3/4）是調(diào)控擬南芥葉基—頂軸極性的兩個基因。ROT3編碼細胞色素P450家族的CYP90C1，參與油菜素內(nèi)脂（BR）的合成，可能通過BR影響細胞的極性擴展來調(diào)節(jié)葉的長度（Kim et al，2005）。ROT4編碼一種小肽，可能通過抑制細胞在基—頂軸方向的分裂來調(diào)節(jié)葉的長度（Narita et al，2004）。擬南芥ANGUSTIFOLIA（Folkers et al，2002； Kim et al，2002）和SPIKE1主要通過影響細胞在中—側軸方向的生長來調(diào)節(jié)葉的寬度（Tsuge et al，1996）， 而ANGUSTIFOLIA3則主要通過調(diào)控中—側軸方向上的細胞數(shù)量來調(diào)控葉的寬度（Horiguchi et al，2005）。葉在基—頂軸和中—側軸兩個軸向上的協(xié)調(diào)生長，決定了葉具有一定的長/寬比（Tsukaya，2006）。At1g10300基因的缺失，可能影響到上述調(diào)節(jié)葉片形態(tài)的相關基因的表達，進而產(chǎn)生葉片長寬比顯著減小的表型。

綜上所述，本研究獲得了At1g10300基因功能缺失的突變體，其與野生型相比出現(xiàn)了明顯的開花延遲，蓮座葉片形態(tài)改變的表型。突變體中開花時間的正調(diào)節(jié)因子CO、GI、FT基因的相對表達量顯著降低，而負調(diào)節(jié)因子FLC基因的相對表達量顯著升高。以上結果表明At1g10300基因在調(diào)控植物的生長發(fā)育中起到重要作用，也為今后深入研究At1g10300基因在植物開花過程和葉形態(tài)建成中的作用打下了基礎。

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突變體植株的蓮座直徑，葉片長度，葉片寬度，葉柄長度，葉片長寬比和葉面積； H. 野生型和At1g10300突變體植株最終植株高度；

I. 展示葉片長度、寬度和葉柄長度的測量方法。n = 20，3次實驗重復，**表示極顯著差異，經(jīng)t檢驗， P<0.01。下同。

Fig. 3At1g10300 mutation effects on leaf morphologyA. Phenotypes of fourweekold wildtype and At1g10300 mutant；

B-G. Rosette diameter， length and width of leaf， length of petiole， ratio of leaf length/width， and leaf area of 24dayold wildtype

and At1g10300 mutant； H. Height of mature wildtype and At1g10300 mutant plants； I. Schematic measuring of length and

width of leaf， and length of petiole. The data were derived from three experiments and are presented as the x ± s

（n = 20 for three experiments， ** means extreme differences， P < 0.01， Student’s ttest）. The same below.

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