運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)的影響

龔云　王超

摘要：探討運(yùn)動(dòng)疲勞引起大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)的變化及其可能機(jī)制。方法：Wistar大鼠40只，隨機(jī)選取10只為正常對(duì)照組（D組），其余采用多級(jí)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立運(yùn)動(dòng)疲勞模型，留其成功的20只為疲勞組（P組）；測(cè)試力竭運(yùn)動(dòng)后2組大鼠血糖、血尿素氮、血乳酸、血清胰島素含量，采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定股四頭肌細(xì)胞GLUT4mRNA的表達(dá)，運(yùn)用免疫組化法觀測(cè)該部GLUT4蛋白的表達(dá)。結(jié)果：力竭運(yùn)動(dòng)后即刻，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖、血清胰島素含量均顯著低于（P<0.05）D組大鼠，而血乳酸水平卻顯著高于（P<0.05）D組大鼠，骨骼肌纖維GLUT4mRNA及蛋白的表達(dá)均較D組大鼠顯著上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)疲勞后大鼠能量基本耗竭、通過(guò)非胰島素途徑迫使機(jī)體以上調(diào)骨骼肌纖維GLUT4tuRNA和蛋白表達(dá)來(lái)應(yīng)激，以此延擱由能量衰竭所引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而形成一種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)來(lái)減緩運(yùn)動(dòng)性外周疲勞的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)疲勞；骨骼肌纖維；GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)；RT-PCR；免疫組化；大鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：G 804.2 文章編號(hào)：1009-783X（2017）02-0182-06 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

在運(yùn)動(dòng)性疲勞外周機(jī)制的研究中，骨骼肌糖代謝是重要的聚焦點(diǎn)，其主要限速步驟是葡萄糖運(yùn)載體4（GLUT4）介導(dǎo)的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究顯示，GLUT4的表達(dá)從根本上決定了其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力；而這種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的高低，又直接影響骨骼肌纖維糖氧化供能的底物水平。巫菲等研究表明，慢性心力衰竭可致大鼠骨骼肌GLIT4mRNA表達(dá)顯著降低。龔豪杰等的研究顯示：2周低氧及低氧訓(xùn)練均能引起野生小鼠骨骼肌GLUT4表達(dá)的增多；1 h不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，野生小鼠骨骼肌GLUT4基因表達(dá)量顯著增加。唐艷婕等研究結(jié)果顯示，游泳訓(xùn)練使T2DM大鼠腓腸肌GLUT4蛋白表達(dá)增強(qiáng)。楊曉冰的研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)可以提高胞膜內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)速率，且能夠增加大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)GLUT4的含量，并促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。運(yùn)動(dòng)性疲勞能量衰竭學(xué)說(shuō)認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)骨骼肌纖維葡萄糖幾近耗竭、ATP生成減少，運(yùn)動(dòng)能力下降而不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。造成這種結(jié)果的原因是否與骨骼肌纖維GLUT4的表達(dá)有關(guān)，相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。本文通過(guò)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建造大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型，測(cè)試力竭后即刻血糖、血尿素氮、血乳酸及血清胰島素的變化，并運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和免疫組化法檢測(cè)大鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表達(dá)水平，旨在從分子水平上探討機(jī)體適應(yīng)性變化規(guī)律及其可能機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)性疲勞外周機(jī)制研究積累有益的資料。

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)環(huán)境

選取8周齡健康雄性Wistar大鼠（SPF級(jí)）40只，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCXK-（甘）-2011-0001），體質(zhì)量175-200 g。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)飼料喂養(yǎng)，自由飲食。室溫23-25℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，安靜無(wú)噪聲。飼養(yǎng)室、用具等每周紫外燈照射消毒。

1.2建模及分組

所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，在動(dòng)物跑臺(tái)（BCPT-96型，中國(guó)杭州錢(qián)江科技工貿(mào)公司）上行3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，淘汰體重過(guò)輕或過(guò)重及不適應(yīng)跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠，后隨機(jī)選取10只為對(duì)照組（D）；剩余大鼠以Bedford的方法為基準(zhǔn)，對(duì)常用的多級(jí)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案加以改良，以此建立大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型：坡度為0、三級(jí)負(fù)荷：I級(jí)負(fù)荷（15 m/min，30 min），Ⅱ級(jí)負(fù)荷（20 m/min，30 min），Ⅲ級(jí)負(fù)荷（25 m/min，60 min），前6 d每天按不同等級(jí)跑一遍，第7天由Ⅲ級(jí)負(fù)荷跑至力竭（跑姿由蹬地式轉(zhuǎn)為伏地式，滯留在跑道上不動(dòng)，聲、光、電刺激及棍棒驅(qū)趕均無(wú)效），留取建模成功大鼠20只為疲勞組（P）。

1.3取材及指標(biāo)測(cè)試

力竭后即刻將每只大鼠準(zhǔn)確稱(chēng)重并尾靜脈取血測(cè)試尿素氮（全自動(dòng)生化分析儀，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院安寧分院檢驗(yàn)科）和血乳酸（便攜式血乳酸儀）。后在深麻醉下（0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射）腹主動(dòng)脈取血測(cè)定血糖（葡萄糖檢測(cè)試劑盒，己糖激酶法）及血清（4℃下3 000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冰箱保存）胰島素（放射免疫分析試劑盒，購(gòu)自濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司）含量。同時(shí)迅速分離兩側(cè)股四頭肌，并切取相同位置5mm3組織2塊，將右側(cè)股四頭肌塊置于10%甲醛溶液固定后，行常規(guī)免疫組織化學(xué)法觀測(cè)細(xì)胞膜上GLUT4蛋白含量。將左側(cè)股四頭肌塊置預(yù)冷生理鹽水中沖洗積血多次，濾紙吸干水分。用標(biāo)記好的錫紙包裹，置于液氮中冷凍過(guò)夜，然后置于-20℃低溫冰箱保存，用RT-PCR法測(cè)定GLUT4mRNA表達(dá)情況。

1.4GLUT4mRNA表達(dá)的RT-PCR測(cè)定

1.4.1總RNA提取及檢測(cè)

將左側(cè)股四頭肌塊從液氮中取出并復(fù)溫，采用UNIQlO柱式Trizol總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）并嚴(yán)格按要求進(jìn)行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度、濃度及完整性檢測(cè)。

1.4.2引物

GLUT4引物序列如下：

Primer 1：5'-GCTTCCTTGGGTTGTGGCAG-3'；Primer 2：5'-CTGGAAACCCGAOGGCATCTTG-3'。

以B-aetin為內(nèi)參照，其引物序列如下：

Primer 1：5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'；Primer 2：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.4.3RT方法

采用Promega公司試劑盒（具體方法詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)）。

1.4.4PCR法

采用上海鼎國(guó)生物工程公司試劑盒（西班牙進(jìn)口分裝）并嚴(yán)格按要求操作。循環(huán)條件：94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后一次可延長(zhǎng)至7 min。

1.4.5結(jié)果分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)JS-380C全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照，使用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值（統(tǒng)一設(shè)定面積294，乘以灰度值面密度即得），將同組GLUT4基因擴(kuò)增產(chǎn)物與B-actin內(nèi)參進(jìn)行比較得基因相對(duì)表達(dá)量，因反色而求其倒數(shù)得最終值，以此比較P組與D組大鼠基因表達(dá)量的差異。

1.5GLUT4蛋白袁迭的免疫組化觀測(cè)

隨機(jī)選取2組大鼠右側(cè)股四頭肌各5塊，切片隔5選1，每塊制成石蠟切片5張、2組共計(jì)50張，常規(guī)脫蠟至水；微波抗原修復(fù)后，按照常規(guī)免疫組化方法制片。在Motic數(shù)碼顯微鏡（BA400/450，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）下觀察上述免疫組化切片，發(fā)現(xiàn)股四頭肌肌纖維呈現(xiàn)棕色，示陽(yáng)性染色，提示有GLUT4蛋白表達(dá)。在1 000倍視野下，每張切片隨機(jī)選擇1張圖像拍照，每張照片選擇2個(gè)細(xì)胞輪廓清晰且陽(yáng)性反應(yīng)較明顯的部位，用Mofie Images Advanced 3.1圖像處理軟件測(cè)量該部位周長(zhǎng)和面積。共計(jì)測(cè)量陽(yáng)性反應(yīng)部位100個(gè)。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。組問(wèn)差異比較采用t檢驗(yàn)，其中差異顯著水平為P<0.05，差異非常顯著水平為P<0.01。

2.結(jié)果

2.1力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠部分指標(biāo)測(cè)試

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻，2組大鼠體重、血尿素氮及血乳酸測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

力竭后即刻，疲勞組大鼠跑姿由蹬地式變?yōu)榉厥?，滯留在跑道末端不能繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，且聲、光、電刺激以及驅(qū)趕無(wú)效。由表1可以看出：體質(zhì)量在2組之間無(wú)明顯變化（P>0.05）；與對(duì)照組相比，疲勞組大鼠BLa、BUN顯著升高（P<0.05）。據(jù)此可以判斷，實(shí)驗(yàn)組大鼠已發(fā)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，本實(shí)驗(yàn)建立的運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠模型是成功的。

2.2力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠血糖及血清胰島素測(cè)試

力竭運(yùn)動(dòng)后即刻，2組大鼠血糖及血清胰島素測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。與D組比較，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻，疲勞組大鼠血糖及血清胰島素水平顯著降低（P<0.05）。

2.32組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4 mRNA表達(dá)的RT-PCR測(cè)試

2.3.1GLUT4mRNA純度、完整性檢驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)260 nm及280nm下測(cè)得大鼠A260/A280的比值，具體結(jié)果見(jiàn)表3。A260/A280的比值均在2.0～2.1，提示所提取的RNA無(wú)降解，且無(wú)殘余的蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)存在，沒(méi)有被碳水化合物、鹽、有機(jī)溶劑污染，無(wú)需純化。同時(shí)，還檢測(cè)了各組大鼠總RNA濃度，發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著性差異，提示提取RNA的過(guò)程中加樣誤差較小。

另外，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，還檢測(cè)了2組大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA的完整性，如圖1所示。RNA樣品電泳后條帶無(wú)雜質(zhì)，且可以顯示28 s、18 s和5 s的小分子條帶。通過(guò)紫外線成像系統(tǒng)觀察，電泳條帶28 s和18 s的比值約為2：1，表明所提取的RNA無(wú)降解，完整性較好。

2.3.2內(nèi)參引物B-actin電泳檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)內(nèi)參引物B-actin條帶清晰，無(wú)雜質(zhì)，在100～250 bp，如圖2所示，與經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的GLUT4mRNA相比較，可以清晰地看到擴(kuò)增出來(lái)內(nèi)參引物B-actin與GLUT4mRNA片段長(zhǎng)度都控制在200 bp左右，如圖2和3所示，說(shuō)明擴(kuò)增效率較為一致，可供后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.32組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4 mRNA的表達(dá)

單鏈的GLUT4mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成了等量且相對(duì)較穩(wěn)定的雙鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，如圖4所示。

從圖4可以看出，B-actin在4組中的表達(dá)基本一致，而P1、P2組GLUT4基因表達(dá)亮度均強(qiáng)于D1、D2組；用Image J軟件做灰度值掃描，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，大鼠P1和P2組的GLUT4基因表達(dá)最終值分別比D1、D2組顯著（P<0.05）增高，提示運(yùn)動(dòng)疲勞致使紋狀體神經(jīng)元GLUT4mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

2.4 2組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4蛋白表達(dá)的免疫組化測(cè)定

力竭運(yùn)動(dòng)后即刻，隨機(jī)選取2組大鼠右側(cè)股四頭肌各5塊行常規(guī)免疫組化實(shí)驗(yàn)，后用數(shù)碼顯微鏡觀察大鼠股四頭肌GLUT4蛋白的表達(dá)，可見(jiàn)其免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞輪廓清晰。在1 000倍視野下拍照，用Motic Image advanced3.1圖像分析系統(tǒng)隨機(jī)對(duì)陽(yáng)性部位進(jìn)行面積和周長(zhǎng)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5和圖5。

從免疫組化切片可以看出，2組大鼠骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4均呈陽(yáng)性表達(dá)。用Motic數(shù)碼顯微鏡可觀察到骨骼肌細(xì)胞中均有大量棕黃色反應(yīng)團(tuán)塊。在1 000倍下可見(jiàn)免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色。與對(duì)照組相比，疲勞組大鼠骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4蛋白陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物面積顯著（P<0.05）增大，且染色深、分布密集，周長(zhǎng)也顯著增長(zhǎng)（P<0.05），見(jiàn)表5和圖5。

3.討論

當(dāng)機(jī)體的生理過(guò)程不能持續(xù)其機(jī)能在一特定水平或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)，將發(fā)生運(yùn)動(dòng)性疲勞。根據(jù)其發(fā)生部位，可分為中樞疲勞和外周疲勞2類(lèi)。外周疲勞主要體現(xiàn)為骨骼肌非有效收縮；然而，有效收縮須依賴(lài)充足的能量供應(yīng)，葡萄糖是機(jī)體能量的重要來(lái)源，葡萄糖穩(wěn)態(tài)是維持機(jī)體諸多生理功能的重要保障?，F(xiàn)已知，葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是骨骼肌細(xì)胞利用葡萄糖的主要限速步驟。這一過(guò)程需依靠細(xì)胞膜上的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_葡萄糖運(yùn)載體（glucose transporters，GLUTs）介導(dǎo)完成。骨骼肌細(xì)胞中存在2種GLUT，分別為GLUTl和GLUT4，前者主要位于骨骼肌細(xì)胞外膜上，只在基礎(chǔ)狀態(tài)下參與細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)；而后者在基礎(chǔ)狀態(tài)下主要位于細(xì)胞內(nèi)的微粒體和某些特定的囊泡等各種內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上，對(duì)胰島素和收縮刺激敏感，是骨骼肌細(xì)胞主要的GLUT。對(duì)GLUT4基因敲除小鼠的研究顯示，無(wú)論在基礎(chǔ)狀態(tài)下、還是胰島素刺激或運(yùn)動(dòng)刺激下，GLUT4對(duì)維持正常葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率是必不可少的。在小鼠、大鼠和人類(lèi)骨骼肌中，GLUT4是主要的亞型。可見(jiàn)，研究運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)骨骼肌細(xì)胞GLUT4mRNA及蛋白表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制是十分有意義的。

本實(shí)驗(yàn)以Bedford早年的方案為基準(zhǔn)略加改造，坡度固定、強(qiáng)度遞增，在行為學(xué)觀察的同時(shí)佐以體重、BUN及Bla指標(biāo)綜合判定疲勞狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：疲勞組大鼠BUN、Bla濃度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而體重2組間并無(wú)顯著差異。在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，因能源物質(zhì)耗竭而使氨基酸分解代謝加強(qiáng)，引起B(yǎng)UN生成過(guò)多致使血清BUN含量升高；Bla是糖酵解的產(chǎn)物，其產(chǎn)量與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度成正比。據(jù)此可以推斷，我們建立的運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠模型是成功的。

有關(guān)運(yùn)動(dòng)與血糖關(guān)系的研究結(jié)果不盡相同。鄭陸等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠負(fù)重游泳至力竭時(shí)血糖水平升高。朱亞林等在其力竭運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血糖濃度幾乎沒(méi)有發(fā)生改變。楊東升等的實(shí)驗(yàn)揭示，力竭運(yùn)動(dòng)過(guò)程中大鼠外周血糖濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠末次跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭，血糖濃度顯著降低（P<0.05）。造成這些不同結(jié)果的原因，除與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)方案、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及頻次有關(guān)外，可能也與其自身調(diào)節(jié)因素有關(guān)。胰島素（insulin，ISN）是體內(nèi)的唯一降糖激素，其作用的主要靶組織是骨骼肌組織和脂肪組織，胰島素首先與骨骼肌細(xì)胞表面受體的a亞基特異性結(jié)合，接著使受體B亞基的多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化，這種磷酸酪氨酸與含有磷酸酪氨酸結(jié)合域的蛋白（主要指IRS-1、IRS-2）相互作用，進(jìn)而激活P13K（磷脂酰肌醇-3-激酶），通過(guò)Akt（PKB）途徑促使GLUT4囊泡膜轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入骨骼肌細(xì)胞被氧化利用，從而造成血糖下訶。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，力竭運(yùn)動(dòng)后實(shí)驗(yàn)組大鼠血清胰島素濃度顯著下降（P<0.05）。這可以解釋為：一方面力竭運(yùn)動(dòng)本身需要耗費(fèi)大量葡萄糖，外加胰島素作用，使血糖濃度顯著降低；另一方面，此時(shí)低葡萄糖負(fù)荷反饋調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞減少胰島素分泌，又造成血清胰島素濃度顯著下降，對(duì)胰島細(xì)胞起到有效的保護(hù)作用。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示我們，運(yùn)動(dòng)疲勞還引起實(shí)驗(yàn)組大鼠GLUT4mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這又作何解釋?zhuān)?/p>

顯然，低葡萄糖、低胰島素不可能作為信號(hào)因子弓I發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而上調(diào)GLUT4mRNA及蛋白表達(dá)。有研究顯示：運(yùn)動(dòng)和胰島素刺激肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)存在不同的機(jī)制。與胰島素效應(yīng)相比，運(yùn)動(dòng)并不增加胰島素受體、IRSl、IRS2酪氨酸磷酸化或P13K活性。對(duì)AMP活化蛋白激酶（AMPK）的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK參與調(diào)解具有收縮活性的骨骼肌多種代謝和生長(zhǎng)過(guò)程。AIVIPK是代謝產(chǎn)物傳感蛋白激酶家族成員之一，并作為燃料計(jì)量器監(jiān)控細(xì)胞能量水平。當(dāng)骨骼肌收縮、缺氧、氧化磷酸化解偶聯(lián)和滲透壓休克時(shí)，AMPK被迅速激活嘲。一方面它能切斷ATP消耗通路并打開(kāi)ATP再生旁路途徑，以此延緩能量迅即衰竭；另一方面，激活的AMPK可能通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄影響GLUT4mRNA表達(dá)上調(diào)，并間接影響其翻譯水平。有關(guān)后者的證據(jù)來(lái)自對(duì)酵母AMPK同系物SNF-1的研究，發(fā)現(xiàn)AMPK在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。賈維娜等的研究顯示，長(zhǎng)期高脂肪酸飲食可致大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)顯著下降。施曼莉等的研究結(jié)果表明，進(jìn)行8周高強(qiáng)度間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，SD大鼠骨骼肌總GLUT4及肌膜GLUT4蛋白表達(dá)顯著增高。劉霞等的研究顯示，長(zhǎng)期的有氧運(yùn)動(dòng)可顯著增強(qiáng)T2DM大鼠脂聯(lián)素-AMPK-GLUT4信號(hào)通路，單純的膳食控制對(duì)改善T2DM大鼠脂聯(lián)素-AMPK-GLUT4信號(hào)通路的作用不大，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合膳食控制對(duì)增加T2DM大鼠骨骼肌AIVIPK和GLUT4有顯著交互作用。張茁等的研究結(jié)果顯示，6周的山柰酚灌胃能顯著上調(diào)KKAy小鼠骨骼肌GLUT4基因及蛋白的表達(dá)，其作用機(jī)制可能和上調(diào)P13K-AKT-GLUT4信號(hào)通路有關(guān)。這樣就可以解釋本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)疲勞引起骨骼肌GLUT4mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)的部分機(jī)制，但進(jìn)一步闡明收縮刺激引發(fā)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的具體路徑和環(huán)節(jié)將是今后骨骼肌生物學(xué)研究的主要目標(biāo)。

4.結(jié)論

1）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良而建造的運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠模型是成功的。2）運(yùn)動(dòng)性疲勞引起大鼠血糖、血清胰島素濃度均顯著下降，卻使血乳酸、血尿素氮濃度顯著增高。3）運(yùn)動(dòng)性疲勞引起大鼠骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)。對(duì)于第2、3條之間的內(nèi)在生理機(jī)制和邏輯關(guān)聯(lián)，我們可以理解為：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建造運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠模型，力竭只是運(yùn)動(dòng)性疲勞的終極階段，疲勞的發(fā)生是動(dòng)態(tài)的累積過(guò)程。大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭，作為能量底物的葡萄糖已基本耗竭，這種低葡萄糖負(fù)荷反饋調(diào)節(jié)胰島素分泌減少；此時(shí)，機(jī)體通過(guò)非胰島素依賴(lài)途徑，即運(yùn)動(dòng)肌肉收縮刺激使AMPK激活，進(jìn)而激發(fā)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而致骨骼肌細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)上調(diào)、促使GLUT4蛋白合成增多并積極轉(zhuǎn)位，以此提高葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，延擱由能量衰竭引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生。