乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關(guān)系

梁振昌

(廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 廣東 中山, 528400)

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乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關(guān)系

梁振昌

(廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 廣東 中山, 528400)

乙型肝炎病毒; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn); 乙肝表面抗原

乙型肝炎病毒(HBV)屬于一種脫氧核糖核酸(DNA)病毒，隸屬于嗜肝DNA病毒科，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界已知的、具有廣泛傳播性的病毒類型，不僅對(duì)患者正常工作生活帶來(lái)嚴(yán)重影響，同時(shí)也在一定程度上加劇了疾控工作壓力與難度，產(chǎn)生的社會(huì)影響較為深遠(yuǎn)[1]。雖然乙型肝炎病毒DNA、抗原、特異性抗體三種標(biāo)志物均可以在乙肝病毒患者外周靜脈血之中被檢測(cè)出來(lái)，但是部分患者在進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，其HBsAg檢測(cè)信號(hào)常常處于灰區(qū)范圍，使得臨床診斷存在較大爭(zhēng)議[2]。本文針對(duì)乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)與乙肝病毒免疫逃逸變異(HBV IEM)的關(guān)系展開深入研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月—2016年2月篩選出來(lái)的100例乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的乙型肝炎病毒患者為研究對(duì)象，其中男65例，女35例; 年齡38～65歲，平均年齡(45.5±1.5)歲; 臨床表現(xiàn)：面色晦暗、食欲不振、消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良、腹脹、上腹部不適。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)確定其乙肝HBsAg檢測(cè)信號(hào)處于灰區(qū)者; ② 無(wú)免疫系統(tǒng)缺陷或疾病者; ③ 已經(jīng)簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 既往具有肝炎史者; ② 生化指標(biāo)數(shù)值劇烈波動(dòng)者; ③ 不同意本次研究方案者。

1.2 方法

在征得所有患者知情同意下采用G6-ELISA以及市面上銷售的ELISA檢測(cè)試劑對(duì)乙肝患者血清免疫逃逸變異HBsAg進(jìn)行檢測(cè)。首先，采用中山生物工程科技有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒HBsAg檢測(cè)試劑盒對(duì)本次研究入組的100例乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的乙型肝炎病毒患者血清HBsAg進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求執(zhí)行。在市售ELISA檢測(cè)工作完畢后實(shí)施G6-ELISA檢測(cè)，具體檢測(cè)流程如下: ① 將單克隆抗體(mAb)采用pH 9.6的碳酸緩沖液進(jìn)行稀釋，隨后將稀釋后的G6-mAb緩沖液逐一添加到酶標(biāo)反應(yīng)板的各個(gè)孔中，劑量以85 μL為宜，于4 ℃環(huán)境下靜置12 h[3]。② 將過(guò)夜的G6-mAb樣本采用加入非離子表面活性劑(Tween-20)的磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)予以洗滌，每次洗滌持續(xù)時(shí)間為60 s, 隨后向其加入2%的牛血清白蛋白(BSA)每孔85 μL, 放置在37 ℃環(huán)境下封閉2 h[4]。③ 將稀釋液樣本中封閉液去除并向其中添加不同稀釋濃度的待檢測(cè)血清樣本，每個(gè)酶標(biāo)反應(yīng)孔50 μL, 同樣置于37 ℃環(huán)境下孵育30 min。④ 洗板步驟同上，再次向其添加50 μL的羊抗HBS-HRP后同樣條件、同樣孵育時(shí)間操作。⑤ 洗板、孵育環(huán)境和時(shí)間同上，再次添加TMB-H2O2溶液進(jìn)行顯色，顯色時(shí)間為10 min, 之后以2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)后將其置于酶標(biāo)儀上，對(duì)450 nm波長(zhǎng)處吸光度進(jìn)行測(cè)定, P/C數(shù)值≥2.1為此次研究陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。

1.3 觀察指標(biāo)

本次研究中所選取的觀察指標(biāo)為不同檢測(cè)方法下血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率及P/C數(shù)值，將P/C數(shù)值在1.20～1.80定義為亞臨界、1.90～2.50定義為臨界、2.60～5.00定義為超臨界，陽(yáng)性率=(亞臨界+臨界+超臨界)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究當(dāng)中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，以卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種檢測(cè)方法血清免疫逃逸變異HBsAg

陽(yáng)性率比較

G6-ELISA檢測(cè)血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率為92%, 而市售ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率為80%, 二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 兩種檢測(cè)方法血清免疫逃逸變異HBsAg陽(yáng)性率比較[n(%)]

與G6-ELISA比較, *P<0.05。

2.2 兩種檢測(cè)方法P/C數(shù)值比較

兩種檢測(cè)方法所得P/C數(shù)值相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩種檢測(cè)方法P/C數(shù)值比較

與G6-ELISA比較, *P<0.05。

3 討 論

乙型肝炎病毒是當(dāng)前世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，盡管乙肝疫苗得到了普遍推廣使用，乙肝患者發(fā)病數(shù)量及概率被有效控制，但是由于近些年來(lái)誘發(fā)乙型肝炎病毒的因素日益增多，使得乙肝病毒重新引起了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。特別是因不良生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)所致的腎臟疾病患者數(shù)量顯著上升，此類患者往往免疫能力較為低下，感染乙型肝炎病毒的概率大幅提升[7]。該病癥如果沒有得到及時(shí)處置，將會(huì)誘發(fā)肝細(xì)胞癌、失代償性肝硬化等一系列并發(fā)癥，危及患者生命安全[8]。此外，臨床檢驗(yàn)工作中乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)異質(zhì)化(灰區(qū))的報(bào)道逐漸增多，使得臨床診療工作開展受到不同程度影響，引起了醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。

既往研究[9-12]證實(shí)，乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的形成因素主要與標(biāo)本或者是檢測(cè)試劑污染、自身免疫物質(zhì)缺乏、食物抗體、血清中某些因子過(guò)量存在具有直接關(guān)聯(lián)性，隨后的研究中臨床檢驗(yàn)規(guī)范化程度也被列入其中。但是，關(guān)于血清免疫逃逸變異HBsAg與乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)之間影響關(guān)系的研究卻尚未系統(tǒng)開展，理論研究方面仍然存在著較大不足之處。因而，本次研究圍繞該課題所展開的深入分析和研究，能夠填補(bǔ)或豐富該領(lǐng)域存在的空白，使得人們對(duì)于二者關(guān)系能夠具有一個(gè)更加清晰的認(rèn)知。同時(shí)則能夠?yàn)橐腋蜨BsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)檢驗(yàn)工作提供幫助，無(wú)論是從理論研究還是實(shí)踐應(yīng)用均具有重要研究?jī)r(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。

本次研究通過(guò)采取G6-ELISA法對(duì)乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)患者血清免疫逃逸變異HBsAg進(jìn)行檢測(cè)，亞臨界檢出18例、臨界35例、超臨界39例，陽(yáng)性檢測(cè)率92%, 而市售ELISA亞臨界15例、臨界32例、超臨界33例，陽(yáng)性檢測(cè)率80%, 二者陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P/C數(shù)值方面, G6-ELISA法所得結(jié)果更加符合實(shí)際，與市售ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可知，乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的患者在排除檢測(cè)試劑影響因素或自身影響因素外，可以被確定為乙型肝炎病毒感染者，而G6-ELISA法對(duì)血清免疫逃逸變異HBsAg具有較高的敏感性。導(dǎo)致此種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因在于目前市面上所銷售的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑采取的單克隆抗體絕大多數(shù)是針對(duì)HBsAg“a”決定簇，或者是與其空間結(jié)果具有關(guān)聯(lián)性的抗原定位點(diǎn)，但是如果乙型肝炎病毒基因發(fā)生了變異，使得抗原性漂移在一定程度上影響了表達(dá)抗原與檢測(cè)試劑中抗體的結(jié)合能力，繼而影響最終檢測(cè)結(jié)果[13-15]。此外，同一抗體對(duì)于血清免疫逃逸變異HBsAg雖然能夠發(fā)生免疫反應(yīng)，但是此種免疫反應(yīng)的親和力相對(duì)較低，同樣是導(dǎo)致乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)出現(xiàn)。

綜上所述，血清免疫逃逸變異HBsAg是導(dǎo)致乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)灰區(qū)的重要原因，提高血清免疫逃逸變異HBsAg檢測(cè)能力有助于臨床診斷乙型肝炎病毒工作開展。

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2017-01-05

廣東省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(20150134)

R 512.6

A

1672-2353(2017)07-179-02

10.7619/jcmp.201707061