布比卡因?qū)τ诖竽c癌細胞的體外抑制作用

李天慈，方愛莉，韓沖芳，楊文曲，賀建東

（1.山西醫(yī)科大學麻醉學系，山西 太原 030032；2.山西醫(yī)學科學院?山西大醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030032）

布比卡因?qū)τ诖竽c癌細胞的體外抑制作用

李天慈1，方愛莉2，韓沖芳2*，楊文曲2，賀建東2

（1.山西醫(yī)科大學麻醉學系，山西 太原 030032；2.山西醫(yī)學科學院?山西大醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030032）

目的探討局麻藥布比卡因?qū)Υ竽c癌細胞的體外抑制作用。方法體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞Caco2，隨機分為不做處理的空白組（N組），經(jīng)1 mM DPBS處理24 h的溶劑對照組（V組）以及經(jīng)1 mM布比卡因處理24 h的實驗組（B組）。本實驗通過Ki67表達水平測定癌細胞增殖能力，通過MTT實驗檢測細胞存活率，并通過Western blot法測量凋亡蛋白caspase3以探尋局麻藥是否可以在體外培養(yǎng)條件下對癌細胞活性起直接抑制作用。結(jié)果在大腸癌細胞中，1mM布比卡因?qū)Π┘毎脑鲋骋种谱饔蔑@著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但并未引發(fā)癌細胞的凋亡。結(jié)論實驗數(shù)據(jù)表明布比卡因不利于大腸腺癌細胞存活。然而基于體外細胞培養(yǎng)的特殊性，此抑制作用需要更多相關(guān)的在體實驗和臨床實驗去驗證。

局麻藥；大腸癌

癌癥作為世界最致命的疾病之一，在2012年造成全球820萬人死亡，預(yù)計2025年將有1930萬新增病例（世界衛(wèi)生組織，2015）。然而因腫瘤的具體發(fā)病機制仍未完全揭示，目前病灶切除術(shù)輔以放化療仍然是大多數(shù)惡性腫瘤的常規(guī)療法。因此，圍手術(shù)期管理對癌癥患者預(yù)后的影響已成為一個熱門的研究課題。值得注意的是，一些臨床回顧性數(shù)據(jù)表明，在手術(shù)期間聯(lián)合應(yīng)用局麻劑與較低水平的癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率相關(guān)[1]。因此，進一步研究局麻藥對癌細胞的作用是必要的。

本研究旨在探討廣泛使用的酰胺類局麻藥布比卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞的影響，以研究酰胺類局麻藥能否在體外培養(yǎng)環(huán)境直接抑制癌細胞。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人大腸腺癌細胞系Caco2購自Public Health England（Salisbury，UK）。用于本研究的培養(yǎng)液為RPMI 1640（L-Glu+，Life Technologies，Paisley，UK），其中混合10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum）（Fischer Scientific，Leicestershire，UK）和1%青霉素-鏈霉素（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）。在McCoy's 5A Medium Modified（Sigma-Aldrich）培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）細胞在加15 mL制備培養(yǎng)液的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并至少每兩天更換一次培養(yǎng)液。從培養(yǎng)瓶底部分離細胞時使用5ml 0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA /瓶，經(jīng)5 min消化后離心10 min，細胞板重懸于30 mL培養(yǎng)基中以在培養(yǎng)瓶中種植（接種密度為5×104個活細胞/cm2）。

1.1.1 培養(yǎng)皿中的細胞接種

在60 mm培養(yǎng)皿和96孔板中，細胞通過細胞計數(shù)器分別按0.8×106/3 mL和5×104/200 μ的密度在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物處理

用制備培養(yǎng)液稀釋布比卡因鹽酸鹽等滲溶液（Marcaine，0.5%w / v，AstraZeneca，Luton，UK）到1 mM，而DPBS（Modified 1×，Thermo Scientific，Utah，USA）與載體以和實驗組相同的比例加入培養(yǎng)液中。當細胞生長面積達90%時給予藥物處理24 h。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

將細胞植于96孔板中培養(yǎng)過夜，各處理組取5個樣孔，每孔加入5 mg/mL的噻唑藍（MTT）（Thermo Scientifc）培養(yǎng)3 h后加入100 μL二甲基亞砜并在室溫下避光放置2 h。充分振蕩后將孔板置于酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm處各樣孔的吸光度（OD值）。各孔內(nèi)細胞存活率為OD值與空白組OD值的比值。

1.2.2 免疫熒光

通過對Ki67免疫染色測定細胞增殖率。將多鳥氨酸包被的玻璃蓋玻片置于培養(yǎng)皿中以利細胞附著。將細胞固定洗后將蓋玻片轉(zhuǎn)移至24孔板，并在室溫下用3%驢血清（Millipore，UK）封閉1 h。隨后將細胞在含有Ki67初級抗體（1：200，鼠多克隆抗體；DakoCytomation，Produktionsvej，Denmark）的PBST中4℃培育過夜。第二天洗滌后避光敷二抗（200μl/孔，1：200，IgG，F(xiàn)lorence；Millipore）1 h。洗滌后滴加DAPI放置到載玻片上。在Nikon E1000M（Nikon，Surrey，UK）熒光顯微鏡下以20×物鏡觀察細胞。用相同的曝光設(shè)置拍攝圖像。

1.2.3 Western blot法

使用Western blot法檢測caspase3的相對表達量。處理或?qū)φ?4 h后，細胞由裂解液分解脂質(zhì)膜。將細胞培養(yǎng)皿置于冰上半小時后離心10 min將蛋白上清液移至新管中，用Bradford（Bio-Rad laboratories，Hercules， CA，USA）蛋白定量測算50 μg蛋白質(zhì)/組的樣本體積。以3：1的比例混合樣品和SDS樣品緩沖液（Invitrogen）后95℃振動10 min。室溫下離心3 min后將樣品與5 μg、Sharp上樣液一起注入NuPAGE4～12%Bis-Tris預(yù)制凝膠（Thermo Scientific，UK）并以200 V電泳50 min。后用蒸餾水漂洗凝膠并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上以甲醇固定，以脫脂乳封閉1 h。使用初級抗體caspase3 p17 （H-60）（3：1000；兔多克隆抗體；Santa Cruz Biotechnology，UK）標定膜。第二天洗膜后在室溫下孵育二抗1 h。用TBST洗滌后，通過增強化學發(fā)光（ECL）系統(tǒng)（Santa Cruz，Dallas，TX，USA）和Syngene GeneSnap軟件（Syngene，Cambridge，UK）成像。本實驗使用GAPDH作為內(nèi)參，用ImageJ評估蛋白質(zhì)條帶的灰度強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以“s”表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

本實驗通過有絲分裂標記物Ki-67蛋白質(zhì)進行免疫染色以檢測增殖狀態(tài)，B組Ki-67陽性比率顯著低于N組和V組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MTT實驗和Western blot實驗中，應(yīng)用1 mM布比卡因24 h并未引起細胞顯著凋亡或壞死以及凋亡蛋白caspase3的表達變化，見表1。

表1 三組Caco2細胞增殖陽性率、存活率和凋亡蛋白表達的比較（n=3，s）

表1 三組Caco2細胞增殖陽性率、存活率和凋亡蛋白表達的比較（n=3，s）

注：與N組相比，ap＜0.05

組別 增殖陽性率 細胞存活率 凋亡蛋白表達N組 92.33±6.74 98.22±1.11 1.06±0.35 V組 98.66±1.17 97.56±2.00 1.24±0.52 B組 54.93±7.64a96.25±2.79 1.35±0.43

3 討 論

根據(jù)以上結(jié)果，1 mM布比卡因處理24 h在Caco2細胞系中可顯著引起細胞周期停滯而不能誘發(fā)細胞凋亡。

噻唑藍可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶水解為藍紫色結(jié)晶甲瓚并被二甲基亞砜溶解，而該反應(yīng)不會出現(xiàn)在凋亡或壞死的細胞中。因此通過對此化學物質(zhì)的吸光值檢測可間接反應(yīng)細胞活性?；诎┘毎陨碓隗w外培養(yǎng)條件下的存活狀態(tài)，對照組/實驗組與空白組的比值可以較為準確地反應(yīng)出藥物處理對細胞活性的影響。

Western blot實驗此處用于檢測大腸癌細胞中凋亡蛋白caspase3在布比卡因處理后的表達水平。Caspase3屬于蛋白水解酶家族并以前體形式存在于胞漿中。當細胞遭遇外界損傷引發(fā)胞內(nèi)caspase家族級聯(lián)反應(yīng)時，caspase3作為下游執(zhí)行蛋白，在前體被水解為活性形式后可誘發(fā)細胞凋亡。本實驗通過檢測caspase3裂解后活性形態(tài)表達量以探尋布比卡因能否抑制癌細胞的活性。

作為細胞增殖的必要蛋白，核蛋白Ki67廣泛存在于間期細胞中。Ki67蛋白質(zhì)僅存在于處于G1-M細胞周期的細胞中，而不存在于靜息或損傷的細胞中，對于靜息細胞和受損細胞，細胞核中Ki67消失。增殖是癌癥進展和惡性腫瘤的另一個重要因素并與許多復(fù)雜的細胞通路相關(guān)聯(lián)，如NF-γB通路和PI3K/Akt/mTOR通路[2]。在本研究中，在1 mM布比卡因處理24 h后，Ki67+細胞的百分比在Caco2細胞中顯著降低，這意味著局麻藥可誘導(dǎo)細胞周期停滯。此外已有實驗證實酰胺類局麻藥羅哌卡因和布比卡因具有對結(jié)腸腺癌細胞的體外抑制作用[3]。

復(fù)合麻醉中局麻藥的使用可以減弱機體免疫抑制，特別是對自然殺傷細胞有活性恢復(fù)作用[4]。同時，進一步研究指出酰胺類局麻藥本身對癌細胞具直接抑制作用[5]。其機制包括通過阻斷電壓門控Na+通道而抑制MAPK轉(zhuǎn)錄途徑降低結(jié)腸癌細胞的侵襲力[6]。此外，酰胺類局麻藥還可以通過TNF-α誘導(dǎo)的Src激活和細胞間粘附分子-1磷酸化來抑制肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，這兩者都不依賴于鈉通道阻滯劑的特性[7]。然而，關(guān)于這類抑制作用的特定分子機制仍然需要更多的研究。

本實驗結(jié)果顯示布比卡因可對結(jié)腸癌細胞的增殖能力發(fā)揮直接抑制作用而不能誘發(fā)顯著凋亡。由于局麻藥的不同應(yīng)用方法會導(dǎo)致較大的血漿濃度跨度，因而此結(jié)論還需要進行更多的時間和濃度相關(guān)性在體實驗和臨床研究去驗證。

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本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.003.547.02

韓沖芳，E-mail：hanchongfang2003@foxmail.com