皖南地區(qū)5家血站集中化血液核酸篩查結(jié)果分析

吳 潔

皖南地區(qū)5家血站集中化血液核酸篩查結(jié)果分析

吳 潔

目的 統(tǒng)計(jì)皖南5家血站（蕪湖、安慶、銅陵、池州及黃山）在2015年12月～2016年6月開展集中化核酸檢測的數(shù)據(jù)，分析并評(píng)價(jià)現(xiàn)階段核酸檢測用于獻(xiàn)血者血液篩查的重要性。方法 對(duì)血清學(xué)檢測結(jié)果陰性的標(biāo)本，采用兩種國產(chǎn)核酸篩查系統(tǒng)（系統(tǒng)A和系統(tǒng)B）檢測，混樣檢測陽性的進(jìn)行拆分，按標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 ①集中化檢測期間對(duì)39 524例核酸標(biāo)本進(jìn)行篩查，檢出HBV DNA陽性標(biāo)本39例，未檢出HCV RNA和HIV RNA陽性樣本。②5家血站（蕪湖、安慶、銅陵、池州及黃山）HBV DNA陽性率分別為0.58‰、1.91‰、0.62‰、1.65‰、1.35‰（χ2=12.82，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③2種檢測系統(tǒng)（系統(tǒng)A和B），HBV DNA檢出率分別為0.81‰和1.38‰，總檢出率為0.99‰。結(jié)論 集中化血液核酸篩查的實(shí)施有效防止了病毒經(jīng)血液傳播，保證了臨床用血質(zhì)量和安全；血液核酸篩查會(huì)有假反應(yīng)性風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生，須做好核酸實(shí)驗(yàn)室污染防控。

皖南地區(qū) 集中化檢測 核酸篩查 國產(chǎn)核酸試劑

根據(jù)國家衛(wèi)計(jì)委有關(guān)文件要求，全國采供血系統(tǒng)于2015年12月底全面開展血液核酸篩查。由于安徽南部（蕪湖、安慶、銅陵、池州和黃山）5家中心血站核酸實(shí)驗(yàn)室建設(shè)進(jìn)展不一致，經(jīng)主管部門統(tǒng)籌協(xié)調(diào)，實(shí)驗(yàn)室暫時(shí)沒有建設(shè)好的血站，啟動(dòng)核酸標(biāo)本送檢檢測模式，統(tǒng)一由蕪湖市中心血站進(jìn)行血液核酸篩查（NAT）。本室使用2套國產(chǎn)核酸檢測系統(tǒng)（系統(tǒng)A和B），對(duì)本站及外站送檢核酸標(biāo)本進(jìn)行篩查，現(xiàn)對(duì)7個(gè)月檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，報(bào)告如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來源與要求 2015年12月1日～2016年6月30日5家血站血清學(xué)檢測合格的核酸標(biāo)本39 524例。核酸標(biāo)本要求：5家血站核酸標(biāo)本采集均使用5 ml BD核酸試管。采集后4 h內(nèi)離心：1 600 g，20 min。2℃～8℃冷藏保存，24 h內(nèi)送檢至檢測單位。若24 h內(nèi)不能送檢，標(biāo)本及時(shí)在-20℃以下冷凍保存。送檢使用帶溫度顯示的標(biāo)本運(yùn)輸箱，全程冷鏈監(jiān)控。18℃～25℃條件下解凍復(fù)融，復(fù)融后再次離心。對(duì)嚴(yán)重脂血、溶血或容量不足的標(biāo)本予以拒收處理。

2 儀器和試劑 儀器系統(tǒng)A、B均使用Hamilton公司STAR混樣提取儀，ABI 7500擴(kuò)增儀各1套；嘉文JW-1044R高速冷凍離心機(jī)；真空采血管脫蓋機(jī)（陽普醫(yī)療DC-1型）。試劑：HBV DNA、HCVRNA、HIV RNA核酸檢測試劑（系統(tǒng)A試劑批號(hào)20151013，2160104，20160410；系統(tǒng)B試劑批號(hào)2015002，2015003）；核酸室內(nèi)質(zhì)控品（康徹斯坦，批號(hào)201506001）。

3 方法

3.1 檢測模式：采用先做酶免后做核酸的模式，只有血清學(xué)檢測合格的標(biāo)本才進(jìn)行后續(xù)核酸篩查。外站也相應(yīng)的對(duì)符合此條件的標(biāo)本進(jìn)行送檢。核酸檢測系統(tǒng)分別使用試劑A和試劑B，2種系統(tǒng)輪換基本為隔天1次，互為備份使用。檢測人員相對(duì)固定。

3.2 檢測方法：2套檢測系統(tǒng)均使用HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA8樣本混合三聯(lián)檢的方式，混檢陽性的pool再用各自系統(tǒng)進(jìn)行拆分檢測。2套系統(tǒng)在前期的混樣和提取，均是使用Hamilton Microlab STAR平臺(tái)為基礎(chǔ)的混樣提取設(shè)備，提取方法一種為磁珠法，另一種為磁棒套法。在后期的擴(kuò)增階段，2套系統(tǒng)均使用ABI 7500擴(kuò)增檢測儀，擴(kuò)增結(jié)果通過各自應(yīng)用軟件傳輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室管理系統(tǒng)。

3.3 判斷規(guī)則與結(jié)果發(fā)布：使用唐山啟奧血站實(shí)驗(yàn)室管理軟件9.0版（以下簡稱9.0軟件），“直接接收”外站標(biāo)本，分析判讀結(jié)果后，經(jīng)9.0軟件出具核酸報(bào)告。采用微信或傳真方式，及時(shí)告知送檢血站檢測結(jié)果，書面報(bào)告在下次送標(biāo)本時(shí)帶回。核酸檢測系統(tǒng)對(duì)拆分無反應(yīng)性的標(biāo)本判為NAT陰性。拆分有反應(yīng)性的標(biāo)本判為NAT陽性，血液報(bào)廢，獻(xiàn)血者系統(tǒng)屏蔽。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

皖南5家血站核酸檢測結(jié)果見表1，對(duì)兩種核酸檢測系統(tǒng)有效拆分率(%)比對(duì)見圖1，集中化檢測前后兩種核酸系統(tǒng)檢測結(jié)果見表2、3。

表1 皖南5家血站核酸檢測結(jié)果（2015.12-2016.6）

圖1 對(duì)兩種核酸檢測系統(tǒng)有效拆分率（%）比對(duì)（2015.12-2016.6）

表2 集中化檢測時(shí)兩種核酸系統(tǒng)檢測結(jié)果比較（2015.12-2016.6）

討 論

經(jīng)過近7個(gè)月的集中化檢測，皖南5家血站共送檢血清學(xué)檢測合格的核酸標(biāo)本39 524份，共檢出HBV DNA陽性39例，陽性檢出率為0.99‰，與鹽城血站的0.90‰[1]較接近，略高于上海的0.63‰[2]、西安的0.66‰[5]、濟(jì)南的0.67‰[4]及合肥的0.68‰⑥，低于南昌的2.64‰[3]。由此可見，全國各地血液核酸陽性檢出率差異較大。可能與下列原因有關(guān)：①當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血人群的HBV病毒流行率差異；②核酸檢測系統(tǒng)的差異，有報(bào)道羅氏核酸操作系統(tǒng)的靈敏度和準(zhǔn)確度高于達(dá)安操作系統(tǒng)[1]，同時(shí)羅氏的靈敏度、特異性和NAT陽性檢出率也明顯高于科華篩查系統(tǒng)[7]；③對(duì)于相同的核酸檢測系統(tǒng)，不同實(shí)驗(yàn)室人員操作差異也是結(jié)果不一致的原因之一。我室雖然使用2套檢測系統(tǒng)，但檢測人員相對(duì)固定，操作過程產(chǎn)生誤差的可能性不大。比較5家血站的核酸陽性檢出率，發(fā)現(xiàn)蕪湖和安慶兩家的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能為：①HBsAg酶免試劑的差異。蕪湖和安慶血站使用的HBsAg酶免試劑廠家不同，雖然沒有比較兩地酶免試劑的靈敏度差異，但眾所周知不同的ELISA試劑在血液HBsAg篩查中，可表現(xiàn)出不同的靈敏度和特異性[8，9，16]；②獻(xiàn)血人群HBV感染率的地域性差異。目前還沒有兩地區(qū)HBV的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，不過我室經(jīng)過調(diào)查：在集中化檢測完成后，安慶血站使用羅氏診斷系統(tǒng)，2016年核酸陽性率從1.9‰約上升到2.6‰。而我室在集中化檢測后，雖然也改為使用羅氏系統(tǒng)，但核酸陽性率一直處于0.9‰左右。因此對(duì)于不同地區(qū)獻(xiàn)血者人群中HBV感染差異性的現(xiàn)象及原因，有待進(jìn)一步探討。

表3 集中化檢測之前兩種核酸系統(tǒng)檢測結(jié)果比較（2014.8-2015.11）

核酸陽性檢出率可反映出試劑的靈敏度或當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血者HBV的感染情況，而與核酸檢測過程相關(guān)的主要指標(biāo)是有效拆分率。有效拆分率理論上應(yīng)是100%，因?yàn)椴鸱謾z測時(shí)，核酸試劑的靈敏度理論上有6倍（羅氏）或8倍（科華、達(dá)安或浩源等）提升，之所以還會(huì)出現(xiàn)無效拆分，可能原因一是病毒濃度低，拆分時(shí)從標(biāo)本未抓取到；二是混檢時(shí)，混樣結(jié)束后可能產(chǎn)生了污染而導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。而且不是直接污染標(biāo)本管，因?yàn)楹罄m(xù)單檢時(shí)所有結(jié)果又均為陰性。表2數(shù)據(jù)顯示，系統(tǒng)A和B的有效拆分率分別為67.74%和48.28%，平均是58.33%，對(duì)比其他單位使用進(jìn)口羅氏COBAS s201檢測系統(tǒng)的有效拆分率情況：成都血液中心58%（33/57）[12]、南寧中心血站65%（133/203）[13]、河南血液中心62% （81/130）[7]、陜西血液中心59%（116/195）[5]、南昌中心血站73%（48/66）[3]、河北血液中心40%（84/209）[15]，顯示我室使用的國產(chǎn)檢測系統(tǒng)和進(jìn)口羅氏系統(tǒng)在有效拆分率上差異不大。

比較發(fā)現(xiàn)2015年12月～2016年3月，每個(gè)月有效拆分率以系統(tǒng)A均高于系統(tǒng)B（圖1）。而且我室的工作模式為兩種系統(tǒng)1天1輪換，在相同時(shí)間、相同檢測人員、相同總體標(biāo)本來源的情況下，出現(xiàn)此現(xiàn)象考慮主要原因：隨著標(biāo)本處理量突然增大幾倍，系統(tǒng)B的檢測系統(tǒng)更容易出現(xiàn)混檢時(shí)假反應(yīng)性結(jié)果。對(duì)比兩種檢測系統(tǒng)在集中化檢測前后的有效拆分率（表2，表3）發(fā)現(xiàn)：前期系統(tǒng)A為58.82%，系統(tǒng)B為63.64%，在集中化檢測4個(gè)月內(nèi)，系統(tǒng)A變化不大，而系統(tǒng)B從之前的63.64%變?yōu)?8.28%，出現(xiàn)較明顯的下降。因此，從防污染操作后的效果來看，系統(tǒng)A要優(yōu)于系統(tǒng)B。國內(nèi)外的報(bào)道也表明，核酸檢測過程中存在假反應(yīng)性現(xiàn)象[13，14，17]，原因可能是一定的實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增[2，13]。

本次集中化血液核酸篩查過程中，只檢出了HBV DNA，未檢出HCV RNA和HIV RNA?？赡茉蛞皇桥c我國是HBV感染大國有關(guān)，HBV感染者占總?cè)丝?.18%[10]；二是因?yàn)镈NA病毒相對(duì)RNA病毒較穩(wěn)定，RNA病毒易被降解，HCV病毒最好的保存條件為-20℃以下。室溫或4℃保存HCV RNA水平會(huì)有一定程度的下降[11]，而DNA則相對(duì)較容易檢出；三是因?yàn)楝F(xiàn)用的ELISA檢測試劑對(duì)HCV和HIV病毒抗體檢出的靈敏度較好，尤其是現(xiàn)用的HIV四代酶免試劑的普及使用，可更大程度的提高對(duì)HIV抗原的檢出。

通過集中化核酸檢測的開展，我室總結(jié)：①做好檢測單位和標(biāo)本送檢單位的協(xié)調(diào)工作，5家單位的聯(lián)系人電話24 h開機(jī)，并充分利用手機(jī)信息軟件，建立QQ群和微信群，進(jìn)行實(shí)時(shí)信息的傳達(dá)和共享。②在標(biāo)本量突然增加，并對(duì)檢測報(bào)告時(shí)限也有要求的情況下，除了要保證試劑、耗材及時(shí)充分供應(yīng)，還要對(duì)工作時(shí)間和模式進(jìn)行合理調(diào)整安排，可補(bǔ)充到本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急預(yù)案中。③保證送檢核酸標(biāo)本的質(zhì)量：須規(guī)定送檢標(biāo)本統(tǒng)一的離心參數(shù)、暫存條件和時(shí)間、送檢時(shí)間和方式、標(biāo)本脂血溶血處理等，標(biāo)本質(zhì)量直接關(guān)系到核酸檢測結(jié)果的有效性。④實(shí)驗(yàn)室若有兩套系統(tǒng)，盡量交換使用，互為備用，這樣也一定程度避免某一套系統(tǒng)停機(jī)時(shí)間過長，對(duì)機(jī)器產(chǎn)生影響。⑤防污染是核酸檢測必須重視的重要問題[13]。尤其是使用國產(chǎn)核酸檢測系統(tǒng)，由于有手工操作步驟，這就要求我們在混樣提取平臺(tái)的消毒和日常操作上加強(qiáng)規(guī)范化操作的管理。

集中化血液核酸篩查的施行，不僅為兄弟血站建立核酸實(shí)驗(yàn)室爭取了時(shí)間，還在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成血液核酸篩查區(qū)域全覆蓋，有效防止了病毒經(jīng)血液傳播，保證了臨床用血質(zhì)量和安全。

(感謝安慶、銅陵、池州和黃山4家血站，在集中化檢測期間互相協(xié)調(diào)配合以及后期數(shù)據(jù)信息的共享。)

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Analysis of Centralized Blood Nucleic Acid Screening in Five Stations of Southern Anhui

WU Jie.
Wuhu Center Blood Station of Anhui Province 241000

Objective Data of DNAs screening in 5 blood stations of southern Anhui province were analyzed from December 2015 to June 2016 so as to was evaluate the significance of blood nucleic acid screening in the donors. Methods Samples that showed seronegative results were detected and analyzed with two domestic nuclei acid screening systems （A and B）. Results A total of 39 524 samples were screened and 39 cases of positive HBV DNAs were found. Neither HCV RNAs nor HIV RNAs were noted. A significant difference of the prevalence of positive HBV DNAs was observed in 5 blood stations ( 0.58‰,1.91‰, 0.62‰, 1.65‰, and 1.35‰（χ2=12.82，P＜0.05）. The two test systems gave rise to the positive rates of 0.81‰ and 1.38‰ for HVB DNAs, with a total positive rate of 0.99‰. Conclusions Centralized screening of blood nucleic acids was effective for prevention of virus transmission and for guarantee of blood quality and safety. Laboratory contaminations must be scrupulously avoided to prevent from false positive DNAs examinations.

Southern Anhui Centralized screening Nucleic acid screening Domestic nucleic acid reagent

R457.1+2 R392.11

A

1671-2587（2017）02-0142-04

2016-12-05）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.014

241000 安徽省蕪湖市中心血站

吳潔（1981–），男，安徽宣城人，主管技師，學(xué)士，主要從事實(shí)驗(yàn)室管理及檢驗(yàn)工作，（Tel）18155366032（E-mail） 893493499@qq.com。