2015年廣州地區(qū)無償獻血者核酸和ELISA檢測結果分析

林詩雅 王 淏 李仲平 梁浩堅 謝君謀 肖韶英 鄭優(yōu)榮

2015年廣州地區(qū)無償獻血者核酸和ELISA檢測結果分析

林詩雅 王 淏 李仲平 梁浩堅 謝君謀 肖韶英 鄭優(yōu)榮

目的 分析2015年廣州血液中心無償獻血者核酸檢測（NAT）和ELISA的篩查結果，探討NAT和ELISA并行的血液篩查模式下，兩種檢測方法在降低輸血相關病毒感染風險的相關性。方法 采用兩種ELISA試劑和單人份核酸檢測（ID-NAT）平行應用的血液篩查模式，對2015年廣州市無償獻血者HBV、HCV和HIV血清學標志物及其病毒核酸進行篩查。核酸初檢陽性標本取其血袋血漿進一步做核酸鑒別實驗。對HIV-1 RNA鑒別陽性、ELISA陰性的獻血者進行追蹤隨訪。結果 本中心2015年核酸檢測標本合計300 250例，其中初檢陽性2 874例，總陽性率0.96%；核酸初檢單陽性628例，單陽性率0.21%；鑒別陽性數129例，總陽性率20.58%，鑒別陽性中127例HBV、2例HIV，未發(fā)現HCV陽性，其中1例HIV-1 RNA單陽性隨訪標本送廣州市疾控中心經確證為陽性。酶免HBV、HCV和HIV與核酸檢測結果比較顯示：核酸與酶免HBV、HCV和HIV檢測均為陽性共2 204例，2 333例HBV ELISA雙試劑陽性標本中78%（1 829/2 333）核酸陽性；343例HCV ELISA雙試劑陽性標本中66%（226/343）核酸陽性；92例HIV ELISA雙試劑陽性標本中全部為核酸陽性。酶免單試劑陽性標本中6%（57/901）為核酸陽性，94%（844/901）為核酸陰性。酶免雙試劑陽性中核酸陽性比例大于酶免單試劑陽性（P＜0.05）。結論 核酸檢測能更進一步縮短輸血傳播疾病的檢測“窗口期”，發(fā)現隱匿性病毒感染，核酸和酶免檢測在降低輸血相關病毒感染風險中發(fā)揮重要的互補作用。

核酸擴增檢 隱匿性HBV感染 窗口期 無償獻血

核酸擴增檢測（ nucleicacid amplification testing，NAT） 是通過擴增病原體核酸進行檢測的一系列技術總稱。與血清學檢測技術ELISA相比，NAT技術靈敏度較高，可直接檢測病原體核酸，是血液中病原體存在的最直接證據。Busch等[1]研究證實核酸檢測能將HBV、HCV和HIV血清學檢測的窗口期分別縮短20天、50天和10天。歐美等許多國家和地區(qū)已將NAT技術應用于獻血者血液篩查[2]。近年來，我國核酸檢測工作也取得了較滿意的效果[3]，本中心自2010年采用NAT和ELISA并行檢測的篩查策略，現回顧性分析2015年核酸和酶免檢測情況，報告如下。

資料與方法

1 研究對象和標本處理 標本來自2015年1月1日～12月31日廣州血液中心無償獻血者，獻血者經HBsAg（膠體金法）和ALT（速率法）快速篩查為合格，且符合《獻血者健康檢查標準》（GB18457-2012）。每位獻血者采用EDTA-K2真空抗凝管留取2管各5 ml血液，核酸檢測標本使用帶分離膠的真空抗凝管留取。所有標本在采血后4 h內（1 600 g，12 min）離心，運輸溫度控制在2℃～8℃，24 h內檢測。獻血者跟蹤采樣采用帶分離膠真空抗凝管留取5 ml，核酸初檢陽性標本取血袋血漿進行核酸拆分實驗。

2 ELISA篩查試劑與儀器 每個ELISA項目采用兩種試劑盒進行篩查，HBsAg：上?？迫A、北京萬泰；抗-HCV：上?？迫A、珠海麗珠；HIV抗原/抗體：法國伯樂；HIV抗原：北京萬泰。均嚴格按照使用說明書操作。儀器：ML-STAR加樣儀（瑞士HAMILTON），后處理使用FAME 24/30全自動酶聯免疫分析儀（瑞士 HAMILTON），340a酶標儀（奧地利Anthos）等。

3 核酸檢測試劑與儀器 應用TIGRIS全自動血液核酸檢測儀（美國諾華公司），配套試劑為Procleix Ultrio assay，核酸鑒別試劑：Procleix Ultrio Discriminatory Assay。

4 檢測策略及檢測結果判定 應用NAT和ELISA法對標本并行檢測，ELISA結果＜Cut off值判為陰性，結果≥Cut off值判為陽性。兩種試劑均呈陰性則為合格，兩種試劑均呈陽性則為不合格，若其中一種試劑結果為陽性，則該項目用兩種試劑各復檢兩孔，均為陰性者則為合格，其中一種為陽性判為不合格。NAT可同時檢測HBV、HCV和HIV-1 3種病毒核酸，反應性結果表明其中有1～3種病毒核酸為陽性。初次檢測反應性標本取血漿袋中血漿分別做HBV、HCV和HIV-1的鑒別檢測，核酸鑒別試驗呈反應性，判定標本為該鑒別項目陽性；若核酸鑒別試驗呈無反應性，則判為鑒別實驗陰性。

5 HIV-1 RNA陽性標本的追蹤與定量 對核酸檢測HIV-1RNA陽性的獻血者在獻血后追蹤采樣。嚴格按照《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》對標本進行采集處理，同時應用上述儀器方法進行NAT和ELISA檢測，并送廣州市疾病預防控制中心用免疫印跡法（Western blot，WB）進行抗體確證試驗。對HIV-1 RNA陽性、ELISA陰性標本及其跟蹤標本進行病毒定量。HIV定量試劑：Cobas?AmpliPrep/COMBAS TaqMan HIV-1 Test，version 2.0。HIV 定量儀器：Cobas? AmpliPrep/ cobas? TaqMan? 核酸定量檢測系統（美國羅氏）。

6 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，率的比較采用卡方檢驗，連續(xù)變量資料采用 t 檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 核酸檢測結果 2015年核酸檢測標本300 250例，其中初檢陽性2 874例，總陽性率為0.96%，各月初檢陽性率的差異有統計學意義（P＜0.05）；核酸初檢單陽性628例，總陽性率為0.21%，各月核酸單陽性率的差異無統計學意義（P＞0.05）；鑒別陽性數129例，總陽性率為20.58%，其中2例HIV、127例HBV，未發(fā)現HCV陽性。各月核酸鑒別陽性率的差異有統計學意義（P＜0.05）。各月數據見表1。

2 HIV-1 RNA單陽性標本跟蹤檢測情況 2例HIV-1 RNA單陽性標本初檢酶免四代試劑S/CO值分別為0.569和0.489，明顯高于三代試劑的0.031和0.087。2號HIV-1 RNA單陽性獻血者獻血后第11天酶免雙試劑轉陽，病毒量由初檢的1.36×104copy/ml上升為1.86×104copy/ml。見表2。

3 核酸檢測與酶免HBV、HCV和HIV檢測結果比較 2015年本中心核酸檢測與酶免HBV、HCV和HIV檢測均為陽性的標本共22 042 832例，2 333例HBV ELISA雙試劑陽性標本中有78%（1 829/ 2 333）核酸陽性；343例HCV ELISA雙試劑陽性標本中66%（226/343）核酸陽性；92例HIV ELISA雙試劑陽性標本中全部為核酸陽性。酶免單試劑陽性標本中有6%（57/901）為核酸陽性。酶免雙試劑陽性中核酸陽性比例大于酶免單試劑陽性（P＜0.05）。見表3、圖1。

表1 2015年廣州地區(qū)無償獻血者各月核酸檢測情況

表2 2份HIV-1 RNA單陽性標本的跟蹤檢測情況

表3 2015年ELISA HBV/HCV/HIV單試劑、雙試劑陽性與核酸結果比較

圖1 2015年ELISA HBV/HCV/HIV單試劑、雙試劑陽性與核酸檢測結果比較

討 論

2015年本中心核酸單陽性標本中鑒別陽性率為20.58%，鑒別陽性標本中127例HBV、2例HIV，未發(fā)現HCV陽性。造成HBV核酸陽性、血清學陰性的原因主要有兩方面：一是獻血者處在ELISA檢測“窗口期“，二是獻血者存在隱匿性HBV感染（occult hepatits B virus infection，OBI）。OBI是由于病毒變異、感染者自身免疫等因素導致HBsAg的結構改變或合成降低，血清HBsAg陰性，但血清或肝組織中仍可檢出HBV DNA。OBI感染者體內HBV DNA往往很低，常低于200 IU/ml[4]。Fang等[5]研究發(fā)現，HBV DNA+/HBsAg- 獻血者中有90%～95%都是OBI。Vermeulen等[6]也發(fā)現核酸HBV單陽性標本主要為OBI，其次是“窗口期”感染。

另外，核酸檢測單陽性標本中鑒別診斷的陰性率高達79.42%，這是單人份核酸檢測中常碰到的問題。這部分核酸檢測單陽性標本有可能是假陽性。Linnen 等[7]研究發(fā)現，采用轉錄介導的擴增（TMA）方法檢測西尼羅河病毒時，細菌、真菌污染以及正常血漿蛋白等因素均可引起非特異性擴增，導致結果假陽性。而這些因素在血液篩查時是否可以引起初檢結果的假陽性還有待進一步探討。另一方面，核酸鑒別陰性可能與標本病毒載量較低有關。姚鳳蘭等[8]采用超速離心濃縮提高病毒滴度后，可提高血液核酸檢測不確定標本的陽性率。在標本病毒量極低時，有可能正好未能吸取到病毒核酸而導致核酸鑒別假陰性。

對2例HIV核酸單陽性標本的初檢酶免S/CO值比較發(fā)現，2例HIV標本酶免四代試劑S/CO值明顯高于三代試劑，但不足以達到灰區(qū)或cut off值水平，這提示ELISA窗口期時P24抗原已經有微量表達，因此對HIV第四代試劑有S/CO偏高的陰性標本應加以重視。HIV酶免四代試劑增加了P24抗原的檢測，比第三代試劑更為敏感，可將HIV檢測“窗口期”平均縮短4～5 d[9]。我們對2號HIV核酸單陽性獻血者成功的進行了跟蹤隨訪，其獻血后第11天酶免雙試劑轉陽，HIV病毒量由初檢的1.36×104copy/ml上升為1.86×104copy/ml。將隨訪標本送廣州市疾病預防控制中心用免疫印跡法（Western blot，WB）進行抗體確證試驗，結論為HIV抗體不確定，帶型為gp120。后經隨訪其第28天抗體確證試驗為陽性，證實此獻血者獻血時處在HIV ELISA檢測“窗口期”。

核酸檢測靈敏度高，直接檢測血清中的病原體，能夠從ELISA陰性標本中檢出ELISA “窗口期”和隱匿性感染者[3]。但是，我們發(fā)現有504份HBsAg ELISA雙試劑陽性、117份HCV ELISA雙試劑陽性標本的核酸檢測為陰性。核酸檢測漏檢的主要原因是部分獻血者血液中病毒載量低于核酸檢測的檢測下限，而抗原抗體水平較高。因此，核酸檢測不能完全替代常規(guī)的ELISA檢測，這是由于部分獻血者血液中抗原抗體水平較高，但是病毒載量極低，這也是核酸檢測漏檢的主要原因[10，11]。ELISA可以檢測出低病毒量的血清學陽性感染者，兩者在降低輸血相關病毒感染風險發(fā)揮重要的互補作用。2012版《血站技術操作規(guī)程》提出：血站可以采用1種ELISA試劑檢測抗原（抗體），同時采用1種試劑檢測核酸的血液篩查模式。如果采用一遍ELISA加一遍核酸檢測，部分核酸陰性、ELISA單試劑陽性標本將會被漏檢，這一部分血液的安全性還有待進一步探討。

總之，核酸檢測能更進一步地縮短輸血傳播疾病的檢測“窗口期”，發(fā)現隱匿性病毒感染，核酸和酶免檢測在降低輸血相關病毒感染風險中發(fā)揮著重要的互補作用。

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5 Yong Fang，Qing-Long Shang，Jian-Yu Liu b ，et al. Prevalence of occult hepatitis B virus infection amang hepatopathy patients and healthy people in China[J]. J Infent，2009，58（5）：383-388.

6 Vermeulen M，Lelie N，Sykes W，et al．Impact of individual-donation nucleic acid testing on risk ofhuman immunodeficiency virus，hepatitis B virus，and hepatitis C virus transmission by blood transfusion in South Africa[J]．Transfusion，2009，49（6） ：1115-1125．

7 Linnen JM，Deras ML，Cline J，et al．Performance evaluation of the PROCLEIX West Nile virus assay on semi-automated and automated systems[J]. J Med Virol，2007，79（9） ： 1422-1430．

8 姚鳳蘭，任芙蓉，王卓妍，等. 超速離心濃縮對提高血液NAT 篩查不確定標本鑒別率的臨床研究[J]．北京醫(yī)學，2009，31 （11） ：687-690．

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Analyses of Laboratory Detections with PCR and ELISA in Blood Donors of Guangzhou in 2015

LIN Shi-ya，WANG Hao，LI Zhong-ping，et al.
Blood Center of Guangzhou, Guangdong Province 510095

Objective To analyze the results of nucleic acid tests（NATs） and ELISA detections and explore the correlation of them in reducing the risk of transfusion related infections. Methods Using two kinds of ELISA reagents and ID nucleic acid detection （ID-NAT） for parallel blood screening in blood donation to detect serological markers of HBV, HCV and HIV-1 and virus nucleic acids. Samples were taken from blood bags for further identification when primary test was positive. HIV-1 RNA positive ELISA negative blood donors were followed up. Results In total of 300 250 cases, 0.96% （2 874/300 250） positive cases were detected in the center in 2015.The nucleic acid single positive rate was 0.21%（628/300 250）; the identification positive rate was 20.58% （129/628）. 127 HBVand 2 HIV cases were found and no HCV was seen. Enzyme immunoassay of HBV, HCV and HIV and nucleic acid detection results discovered 2 204 positive cases . 78%（1 829/2 333） HBV ELISA double reagent positive specimens were NAT positive, and 22%（504/2 333） were NAT negative; 66%（226/343） HCV ELISA double reagent positive specimens were NAT positive, and 34%（117/343） were NAT negative; 92 cases of HIV ELISA double reagent positive samples were all NAT positive. Six percent（57/901）ELISA single reagent positive were NAT positive, and 94%（844/901）were NAT negative. The percentage of positive nucleic acid in ELISA double reagent positive was higher than single reagent positive ELISA（P＜0.05）. Conclusion NAT helps shorten "window period" of transfusion transmitted diseases and detect latent infection. Both NAT and ELISA play an important complementary role in reducing the risk of blood transfusion associated virus infection.

Nucleic acid amplification detection OBI Window period Voluntary blood donation

R392.11 R193.2

A

1671-2587（2017）02-0137-05

2016-10-27）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.013

510095 廣東省廣州血液中心

林詩雅（1985–），女，廣東廣州人，檢驗師，學士，主要從事血液檢驗工作，（E-mail）845884359@ qq.com。

鄭優(yōu)榮，男，主任技師，碩士，（Tel）13826036601。