一株粘細(xì)菌Myxococcussp. STXZ90的分離鑒定及生物活性分析

黃同龍,雷良?xì)g,廖繼燕,周 偲,吳雨婧,李 純,魏 慧,夏立秋,丁學(xué)知,張友明

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

一株粘細(xì)菌Myxococcussp. STXZ90的分離鑒定及生物活性分析

黃同龍,雷良?xì)g,廖繼燕,周 偲,吳雨婧,李 純,魏 慧,夏立秋,丁學(xué)知,張友明

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

采用滅活大腸桿菌誘導(dǎo)法分離粘細(xì)菌，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rRNA基因序列同源性分析，對(duì)其進(jìn)行鑒定并歸類.并通過平板對(duì)峙法、腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)粘細(xì)菌代謝產(chǎn)物的抑菌和抗腫瘤活性，RP-HPLC分離抗腫瘤活性物質(zhì).分離得到一株粘細(xì)菌，鑒定結(jié)果表明該菌株為黃色粘球菌，將其命名為Myxococcussp. STXZ90(簡(jiǎn)寫為STXZ90).抑菌試驗(yàn)表明，STXZ90對(duì)多種人類病原菌及魚類致病細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有較高的抑制活性；STXZ90發(fā)酵上清的甲醇粗提物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有廣譜高效的抑制腫瘤細(xì)胞活性，對(duì)Hep-3B，Hela和HUVEC等的最低半抑制濃度(IC50)為0.279～1.228 mg/L.對(duì)該甲醇粗提物進(jìn)行RP-HPLC分離，得到2個(gè)較純的單峰物質(zhì)，體外腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該組分有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞活性.

粘細(xì)菌；次級(jí)代謝產(chǎn)物；高效液相色譜

粘細(xì)菌(myxobacteria)是土壤中較為常見的一類單細(xì)胞革蘭氏陰性細(xì)菌，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞桿狀，具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為，可以滑行運(yùn)動(dòng)，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異、種類多樣、活性高效的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生態(tài)環(huán)境等方面具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值[1-9].據(jù)Dawid報(bào)道，在2 000多株溶細(xì)菌的粘細(xì)菌中，有55%能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)；在700多株溶纖維素的粘細(xì)菌中，有95%可產(chǎn)生生物活性物質(zhì)[10].安布替星(ambruticin)是粘細(xì)菌來源的第一個(gè)確定化合物結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)，分離自纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗真菌作用，可用于麻醉藥及其輔助用藥[11].抗生素TA是1973由Rosenberg等[12]從粘細(xì)菌中分離得到的第一個(gè)抗生素，來自橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物.纖維堆囊菌產(chǎn)生的epothilons是與紫杉醇具有相同作用機(jī)制的十六元聚酮大環(huán)內(nèi)酯化合物，是一種很好的抗癌新藥，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等都有很好的抑制效果，且IC50(最低半抑制濃度)都在納摩爾水平[13]. 粘細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類豐富，大部分具有抑菌、抗腫瘤活性，是新型生物活性物質(zhì)的來源[14-15].本研究對(duì)分離純化的粘細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察、菌種鑒定分類歸屬，豐富了粘細(xì)菌菌種資源，同時(shí)為今后粘細(xì)菌的分離純化和次級(jí)代謝產(chǎn)物中新型活性物質(zhì)的篩選打下良好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 通過多點(diǎn)取樣法從湖南益陽(yáng)菜地采集得到.

1.1.2 供試菌株 人類病原細(xì)菌產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念球菌(Moniliaalbican)及魚類致病細(xì)菌嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.3 供試細(xì)胞株 小鼠黑色素腫瘤細(xì)胞(B16)、人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)、小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)、人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人類肝癌細(xì)胞(Hep-3B)、人結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480)、人正常細(xì)胞臍靜脈上皮細(xì)胞(HUVEC)，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.4 培養(yǎng)基 WAX固體培養(yǎng)基(CaCl2·2H2O 1 g, HEPES 0.5 g, Agar 15 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2)；MD1液體培養(yǎng)基(Casein Peptone 6 g，Starch 2 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2)；LB液體培養(yǎng)基(Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL)；CTT固體培養(yǎng)基(Casein Peptone 10 g, MgSO4·7H2O 1.97 g, KH2PO4/K2HPO4Buffer(pH 7.6) 1 mmol/L, Tris·HCl Buffer(pH 7.6) 10 mmol/L, Agar 15 g, H2O 1 000 mL, pH 7.6).

1.2 粘細(xì)菌的分離

1.2.1 土樣的預(yù)處理 采集土樣，風(fēng)干研磨，過篩，稱取土樣3 g，加入到2 mL抗生素混合液中(慶大霉素30 g/L，卡那霉素8 g/L，氨芐青霉素30 g/L)，再加入15 g/L的放線菌酮1 mL，55℃水浴10 min，放置過夜，在分離前再55 ℃水浴10 min[16].

1.2.2 滅活大腸桿菌誘導(dǎo)法 離心收集大腸桿菌，高溫滅菌，再將大腸桿菌糊用剪尖的藍(lán)色槍頭滴加在WAX平板上(WAX平板已加入25 mg/L放線菌酮)，將處理后的土樣滴加在滅活大腸桿菌旁，30 ℃培養(yǎng)3 d后開始觀察子實(shí)體形成情況.

1.2.3 粘細(xì)菌的純化 大腸桿菌有被蝕刻的痕跡、且長(zhǎng)出粘細(xì)菌子實(shí)體時(shí)，在體式顯微鏡下，反復(fù)多次將子實(shí)體轉(zhuǎn)接到新的WAX平板上，直至LB液體培養(yǎng)基驗(yàn)純培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)過夜后粘細(xì)菌呈塊狀或薄膜狀，而培養(yǎng)液澄清，此時(shí)，則認(rèn)為已獲得純培養(yǎng)，然后將純化的粘細(xì)菌轉(zhuǎn)接到MD1液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min，培養(yǎng)7 d，25%甘油保藏，置于 -80 ℃冷凍保藏.

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 將分離純化得到的粘細(xì)菌接于WAX平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d后，體式顯微鏡下觀察菌落及子實(shí)體形態(tài).并將該菌接到MD1液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，取菌體進(jìn)行革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察.并取菌體在掃描電鏡下觀察其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞形態(tài).

1.3.2 生理生化特征觀察 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]和Lyudmila(2000)[18]等的方法進(jìn)行.

1.3.3 16S rRNA 基因擴(kuò)增、測(cè)序與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹參照文獻(xiàn)[16]中的方法進(jìn)行.

1.4 STXZ90菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及其在不同生長(zhǎng)時(shí)期的抗腫瘤活性

1.4.1 STXZ90菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 本研究采用稱重法測(cè)粘細(xì)菌的生長(zhǎng)量：從平板上將粘細(xì)菌轉(zhuǎn)接到MD1液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床，擴(kuò)大培養(yǎng)4 d，然后將其轉(zhuǎn)接到500 mL裝有玻璃珠和MD1液體培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床培養(yǎng)3 d后，按5%的接種量將其轉(zhuǎn)接至30個(gè)搖瓶中，每隔12 h取一瓶離心收集菌體，去掉表面水分，稱取并記錄質(zhì)量.

1.4.2 STXZ90菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期的抗腫瘤活性測(cè)定 取遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的發(fā)酵上清各1 mL，過濾除菌后，取10 μL檢測(cè)其細(xì)胞毒性，同時(shí)取MD1液體培養(yǎng)基10 μL作為對(duì)照，發(fā)酵上清和對(duì)照各做3 個(gè)平行.培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化.

1.5 STXZ90菌株的抑菌活性

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法(Plate Confrontation Culture Method)，檢測(cè)STXZ90對(duì)供試人類病原細(xì)菌產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念球菌(Moniliaalbican)及魚類致病細(xì)菌嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)的抑菌效果.粘細(xì)菌在MD1液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右至含有大量成團(tuán)菌體時(shí)，用槍頭打散菌體后，取1 mL菌體，均勻涂布于CTT固體平板上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d左右至子實(shí)體長(zhǎng)出.取各受試菌的菌保液在LB固體培養(yǎng)基平板上稀釋劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，分別轉(zhuǎn)接到裝有1.4 mL LB液體培養(yǎng)基的1.5 mL EP管中，在管蓋上用注射器針頭扎小孔，37 ℃，1 000 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h，各取100 μL，用涂布器均勻涂抹于CTT固體培養(yǎng)基平板上，待平板吹干后，用藍(lán)色槍頭扎取培養(yǎng)平板上的STXZ90菌株，將其倒扣在涂布好的指示菌平板上，用同樣的方法扎取CTT固體培養(yǎng)基做對(duì)照，每組3個(gè)平行，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)6 d[19].

1.6 STXZ90菌株抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化

1.6.1 XAD-16樹脂吸附 STXZ90菌株于MD1液體培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d后，取發(fā)酵上清液300 mL，12 000 r/min離心去菌體，取6 mL XAD-16樹脂濕熱滅菌后，加入粘細(xì)菌發(fā)酵上清液中，轉(zhuǎn)入500 mL大搖瓶，在30 ℃搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速100 r/min，使活性物質(zhì)被充分吸附，放置2～3 d.

1.6.2 XAD-16樹脂洗脫 用濾紙過濾得樹脂，加入10倍原始上清液的無菌水洗滌樹脂后，用10倍樹脂體積的甲醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，除菌后進(jìn)行多種細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其活性，并用MTT法檢測(cè)其對(duì)多種細(xì)胞的抑制率并計(jì)算IC50.

1.6.3 甲醇粗提物的RP-HPLC分析 抽濾色譜純乙腈和水作流動(dòng)相溶液，在安捷倫1290上進(jìn)行C18柱反相高效液相色譜，檢測(cè)甲醇粗提物，根據(jù)色譜分離峰圖譜來判斷粗提物的物質(zhì)復(fù)雜程度.對(duì)分離較好的峰進(jìn)行反復(fù)收集，再進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒性試驗(yàn)，檢測(cè)其抗腫瘤活性.

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 從圖1可以看出，STXZ90培養(yǎng)液呈黃色，在WAX平板上表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)性，能蝕刻大腸桿菌，子實(shí)體由中心向四周輻射狀展開，子實(shí)體周圍有透明的液體，菌落粘稠難挑取，革蘭氏染色呈陰性，掃描電鏡顯示細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，細(xì)胞末端呈略尖的錐形，細(xì)胞大小約為4.0 μm×0.7 μm，無鞭毛.

注：a:WAX平板上(×25);b:MD1液體培養(yǎng)基中; c:普通光學(xué)顯微鏡下( 10×100);d:SEM下(×18 000)圖1 STXZ90菌株的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of strain STXZ90

2.1.2 生理生化特征 STXZ90生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中粘細(xì)菌特性相符合.

表1 STXZ90的生理生化特征

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 STXZ90的16S rRNA 基因序列長(zhǎng)度為1 602 bp，在NCBI上經(jīng)過BLAST分析，結(jié)果表明該菌株屬于粘球菌屬，與Myxococcussp. XAC 03有最高相似性，同源性為99%，但STXZ90在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與各亞種分開形成新的分支，不與Myxococcussp. XAC 03屬于同一亞種，結(jié)合16S rRNA序列分析和菌株的形態(tài)及生理生化結(jié)果，將STXZ90命名為Myxococcussp. STXZ90.利用MEGA 6的Kimura-2-Parameter模型，運(yùn)用鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示.

圖2 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 STXZ90菌株在不同生長(zhǎng)時(shí)期代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性

圖3 STXZ90菌株的生長(zhǎng)曲線 Fig.3 The growth curve of myxobacteria STXZ90

利用稱重法測(cè)定STXZ90的生長(zhǎng)曲線，并取其4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，即遲緩期(12 h)、對(duì)數(shù)期(36 h)、穩(wěn)定期(96 h)和衰亡期(240 h)的發(fā)酵上清，檢測(cè)其細(xì)胞毒性.該菌在接種后便迅速調(diào)整進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在72 h菌體質(zhì)量達(dá)到最大，進(jìn)入穩(wěn)定期，但其穩(wěn)定期在整個(gè)細(xì)胞周期中占比少，時(shí)間只有對(duì)數(shù)期的一半，在108 h即進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量開始減少，如圖3所示.細(xì)胞進(jìn)入衰亡期后生物量減少，說明衰亡期細(xì)胞可能發(fā)生裂解或營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞形成抵御不良環(huán)境的粘孢子.

圖4顯示了不同生長(zhǎng)時(shí)期的STXZ90發(fā)酵上清對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的增殖抑制效應(yīng)，從圖中可知，在STXZ90對(duì)數(shù)期，即12 h時(shí)，其發(fā)酵上清就顯示了一定程度的抑制效應(yīng)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，36 h和96 h時(shí)抑制效應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)，這說明在對(duì)數(shù)期STXZ90產(chǎn)生的抗腫瘤細(xì)胞活性物質(zhì)逐漸積累，從對(duì)數(shù)期持續(xù)到穩(wěn)定期.進(jìn)入穩(wěn)定期(96 h)后，抗腫瘤活性物質(zhì)可能并未繼續(xù)積累，圖4顯示240 h抗腫瘤活性并未明顯高于96 h，說明活性物質(zhì)的積累主要在對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期，可能是活性物質(zhì)合成的代謝途徑受到反饋抑制.后期擬通過改變培養(yǎng)條件或采用分子克隆手段突變代謝途徑中的某些堿基來增加活性物質(zhì)的產(chǎn)量.

a:CK( MD1液體培養(yǎng)基); b:12 h; c:36 h; d:96 h; e:240 h圖4 STXZ90菌株在不同生長(zhǎng)時(shí)期代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性(10×10)Fig.4 The cytotoxic effects of fermentation supernatant of myxobacteria STXZ90 of different growth phase on B16(10×10)

2.3 STXZ90菌株的抑菌活性

如圖5～6所示，以平板上接種的STXZ90為中心出現(xiàn)的透明圈顯示了STXZ90對(duì)5種受試人類致病細(xì)菌和4種魚類致病細(xì)菌的抑菌活性，透明圈的大小顯示出STXZ90對(duì)不同致病細(xì)菌的抑制效果有明顯的差異性，其對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes、鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium、普通變形桿菌Proteusvulgaris、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、白色念球菌Moniliaalbican、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、維氏氣單胞菌Aeromonasveronii、豚鼠氣單胞菌Aeromonascaviae、遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda具有高效的抑制活性.STXZ90對(duì)多種人類致病菌和魚類致病菌具有抑制作用，說明STXZ90具有開發(fā)抗菌藥物的價(jià)值，同時(shí)對(duì)于魚類疾病的防治也具有重要意義.

a:產(chǎn)氣腸桿菌; b:鼠傷寒沙門氏菌;c:普通變形桿菌; d:金黃色葡萄球菌; e.白色念球菌.1: CK(CTT 固體培養(yǎng)基); 2:STXZ90圖5 STXZ90菌株對(duì)不同人類病原菌的抑制效果Fig.5 The inhibition of STXZ90 to different human pathogens

a: 嗜水氣單胞菌; b: 維氏氣單胞菌; c: 豚鼠氣單胞菌;d: 遲緩愛德華氏菌.1: CK(CTT固體培養(yǎng)基); 2:STXZ90圖6 STXZ90菌株對(duì)不同魚類病原菌的抑制效果Fig.6 The inhibition of STXZ90 to different fish pathogens

2.4 STXZ90菌株抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化

將甲醇洗脫物配置成不同濃度梯度，分析其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞毒力大小，以測(cè)其對(duì)多種細(xì)胞的半致死濃度.濃度為1.33 mg/L的甲醇洗脫物能很好地抑制多種腫瘤細(xì)胞，且對(duì)正常細(xì)胞HUVEC作用效果比較弱(見圖7).在此濃度下，該粗提物對(duì)Hep-3B,Hela,SMMC-7721,B16,4T1,SW480和HUVEC的抑制率分別為：90.06%，85.42%，88.10%，89.88%，86.34%，65.34%和34.94%(如圖8).利用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析該粗提物對(duì)各腫瘤細(xì)胞最低半抑制濃度(IC50)，其對(duì)Hep-3B，Hela，SMMC-7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的最低半抑制濃度分別為：0.328,0.454,0.279,0.453,0.633,0.926和1.228 mg/L(表2).本文結(jié)果顯示STXZ90的發(fā)酵粗提物表現(xiàn)出廣譜高效的抗腫瘤活性，對(duì)發(fā)酵粗提物中活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化并找到活性最高組分具有重要意義.

Ⅰ(a-b): Hep-3B; Ⅱ(a-b): Hela; Ⅲ(a-b): SMMC-7721; Ⅳ(a-b): B16; Ⅴ(a-b): 4T1; Ⅵ(a-b): SW480; Ⅶ(a-b):HUVEC； (Ⅰ-Ⅶ) a: CK(甲醇); (Ⅰ-Ⅶ) b: 100%甲醇洗脫物圖7 甲醇洗脫物對(duì)不同細(xì)胞的毒性效果(10×10)Fig.7 The cytotoxic effects of the methanol elution on different cells(10×10)

CellsHep-3BHelaSMMC-7721B164T1SW480HUVECIC50/(mg·L-1)0.3280.4540.2790.4530.6330.9261.228

圖8 甲醇洗脫物對(duì)不同細(xì)胞的抑制率Fig.8 The inhibition of the methanol elution to different cells

對(duì)甲醇洗脫物進(jìn)行C18柱反相高效液相色譜分析，見圖9.收集分離的各個(gè)單峰，冷凍干燥去除色譜流動(dòng)相后，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn).如圖10所示，保留時(shí)間分別為12.920和13.804 min的單峰物質(zhì)對(duì)B16細(xì)胞有細(xì)胞毒性，其中保留時(shí)間為13.804 min的峰物質(zhì)活性最高且峰型對(duì)稱(圖10c)，說明此物質(zhì)較純.與加甲醇對(duì)照組相比，活性組分作用后腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其不能保持貼壁形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)不飽滿，兩端出現(xiàn)抽絲且變圓.

圖9 甲醇洗脫物RP-HPLC色譜圖Fig.9 The RP-HPLC chromatogram of the methanol elution

a:CK (甲醇); b:保留時(shí)間為12.920 min峰的對(duì)應(yīng)物; c:保留時(shí)間為13.804 min峰的對(duì)應(yīng)物圖10 分離的2個(gè)單峰物質(zhì)對(duì)B16細(xì)胞的毒性效果(10×10)Fig.10 The cytotoxic effects of compounds of the single peaks to B16(10×10)

3 討論

粘細(xì)菌在土壤中比較常見，但由于粘細(xì)菌很難由單個(gè)的細(xì)胞形成單克隆，且代時(shí)較長(zhǎng)，易于夾雜其他細(xì)菌、真菌、阿米巴和線蟲等特點(diǎn)，給粘細(xì)菌的分離和純化帶來極大困難.因此，粘細(xì)菌和一般細(xì)菌的分離純化不同.一般情況下，得到一株純的溶菌群類的粘細(xì)菌菌株需要幾個(gè)月的時(shí)間，而某些纖維素類的粘細(xì)菌耗時(shí)更長(zhǎng)，常需 1～2 年的時(shí)間[20].為提高粘細(xì)菌篩選效率，利用現(xiàn)代分子技術(shù)建立新篩選模型成為粘細(xì)菌分離純化的研究熱點(diǎn).如蔣德明等[21]利用分子生物學(xué)技術(shù)來分析海底粘細(xì)菌的多樣性，建立基因庫(kù)；高秀珍[22]利用微包埋技術(shù)，獲得粘細(xì)菌的單克隆，提高了純化的效率.但由于各種條件的限制，這些分離純化方法的適用范圍并不廣.本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌誘導(dǎo)子實(shí)體法，從土壤中分離得到粘細(xì)菌STXZ90，屬于粘球菌屬[23].本文的抑菌實(shí)驗(yàn)表明，STXZ90對(duì)多種人類病原菌及魚類病原菌如產(chǎn)氣腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等都有較高的抑制活性.作者推測(cè)STXZ90的抑菌功能與其產(chǎn)生水解酶的功能有關(guān).已有研究發(fā)現(xiàn)，粘細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)條件缺乏時(shí)能通過產(chǎn)生水解酶降解多種細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)供自身生長(zhǎng)所需，如Hillesland等[24]發(fā)現(xiàn)粘球菌能在共培養(yǎng)時(shí)降解Escherichiacoli,Corynebacteriumglutamicum,Micrococcusluteus，Saccharomycescerevisiae等多種細(xì)菌.近年來從粘球菌中分離得到多種抗腫瘤活性物質(zhì)，如3-O-methyl-myxochelin A[15]及Myxothiazol[25]等.本研究中細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，STXZ90的甲醇粗提物對(duì)Hep-3B,Hela,SMMC-7721,B16,4T1,SW480和HUVEC的最低半抑制濃度分別為：0.328,0.454,0.279,0.453,0.633,0.926和1.228 mg/L.將STXZ90的甲醇粗提物進(jìn)行RP-HPLC分析，得到2個(gè)單峰物質(zhì)，均顯示了不同程度的B16腫瘤細(xì)胞毒性，其保留時(shí)間分別為12.920和13.804 min，其中保留時(shí)間為13.804 min的峰物質(zhì)活力最高且最純凈.具有抗菌和抗腫瘤活性的粘細(xì)菌新菌株STXZ90的發(fā)現(xiàn)，豐富了微生物藥用菌種資源庫(kù)，也為藥物先導(dǎo)分子的研發(fā)進(jìn)行了初步探索.

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(編輯 WJ)

On Isolation, Identification and Bioactivitiy ofMyxococcussp. STXZ90

HUANGTong-long,LEILiang-huan,LIAOJi-yan,ZHOUCai,WUYu-jing,LIChun,WEIHui,XIALi-qiu,DINGXue-zhi,ZHANGYou-ming*

(State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology,College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

The inactivatedEscherichia.coli-dependent fruiting baiting technique was used to isolate myxobacterial strains. Based on the phylogenetical characteristics, physiological and biochemical properties and 16S rRNA gene sequence homology analysis, the isolated strain has been identified and classified. The inhabitation of the strain to different pathogens and tumor cells were detected by the Plate Confrontation Culture Method and tumor cell toxicity experiment. The antitumor substance was further purified by RP-HPLC. Our results showed that the strain belonged tomyxococcusxanthusand thus it was named asMyxococcussp. STXZ90(STXZ90). The antibacterial experiment indicated that STXZ90 had bacteriostatic activity to different human pathogens and fish pathogens, such asEnterobacteraerogenes, andAeromonashydrophil. The methanol elution of the fermented supernatant of STXZ90 exhibited a broad spectrum and high effect on various tumor cell lines. TheIC50(half maximal inhibitory concentration) to Hep-3B,Hela, and HUVEC were between 0.279 to 1.228 mg/L. The methanol elution was further purified by RP-HPLC with 2 single peak fragments obtained, which displayed strong inhibitory activities to cancer cells.

Myxobacteria; secondary metabolite; HPLC

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.004

2016-04-30

國(guó)家國(guó)際合作資助項(xiàng)目(2011DFA32610)；國(guó)家“973”計(jì)劃專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012CB722301)；國(guó)家“863”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011AA10A203)；湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(20134486)

Q939

A

1000-2537(2017)02-0025-08

*通訊作者,E-mail：zhangyouming@sdu.edu.cn