口蹄疫病毒直接實時熒光RT—qPCR檢測方法的建立

吳曉衛(wèi)+翟建新+杜維+鐘文楊+張利

摘要：根據(jù)口蹄疫病毒VP1基因保守序列，設(shè)計出1對口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特異性探針FMD-Pb序列，建立了一種簡便、快速、高效的口蹄疫病的直接實時熒光RT-qPCR（dRT-qPCR）檢測方法。結(jié)果表明，在特異性方面，對口蹄疫病毒7個血清型的檢出率100%；在靈敏度方面，其與常規(guī)提取RNA方法對比，陽性檢出率差別很??；在對133份未知樣本檢測方面，dRT-qPCR方法檢出陽性88份，常規(guī)方法檢出陽性84份。dRT-qPCR方法的檢測結(jié)果更可靠，適于對大量樣本進行檢測。

關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒；直接實時熒光RT-qPCR；特異性；診斷檢測

中圖分類號：S852.65 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1165-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.043

Abstract：According to the Foot-and-Mouth disease virus （FMDV） VP1 gene conserved sequence，primers （FMD-F， FMD-R） and specific probe（FMD-Pb） were designed respectively. FMDV was detected fast and conveniently by directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）. The results showed that the detection rate of 7 serotype of FMDV by dRT-qPCR was 100%. Moreover， there wasnt significantly difference between dRT-qPCR and conventional method. In the unknown-sample-detection， by dRT-qPCR method， 88 positive samples could be detected in the 133 unknown samples， while only 84 positive samples were detected by conventional method. dRT-qPCR method， with rapid， accurate， specific and sensitive advantage， can be used for the diagnosis detection and real-time monitoring of FMDV.

Key words：Foot-and-Mouth disease virus； directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）； specificity； diagnosis detection

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）是口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）的病源體，能夠感染豬、牛、羊等偶蹄獸引起急性、烈性、接觸性傳染病[1]。研究表明，感染口蹄疫病毒的牲畜常呈現(xiàn)進食量下降，機體抵抗力和免疫力降低，并容易繼發(fā)其他病毒性疾病和細(xì)菌性疾病，從而造成受感染動物的生產(chǎn)性能下降，危害畜牧業(yè)正常生產(chǎn)和發(fā)展[2]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將口蹄疫列為必須報告的動物傳染病，中國將其歸為一類動物疫病[3]。

FMDV共有7個血清型，即C型、A型、O型、 Asia Ⅰ型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型和SAT Ⅲ型，每個血清型又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之間僅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的診斷和控制更加困難[4]。目前，口蹄疫病毒感染的特異性診斷技術(shù)包括病原學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等6種方法[5]，即病毒分離法、血清學(xué)檢測技術(shù)、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）以及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative reverse transcriptase PCR，RT-qPCR）和基因芯片技術(shù)。病毒的分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法存在耗時長、陽性檢出率低、敏感性較差、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點[6]，在實際應(yīng)用中具有一定的局限性，無法滿足大量樣本的快速診斷。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈（RT-qPCR）的檢測技術(shù)需要提取病毒RNA，再進行qPCR擴增和后續(xù)產(chǎn)物處理，在處理痕量樣本上，提取病毒RNA過程容易發(fā)生RNA降解或交叉污染等事件，仍存在較大困難，無法高通量、低成本、高效率地快速檢測[7]?；蛐酒夹g(shù)對引物探針設(shè)計要求非常高，成本消耗大、結(jié)果假陽性率偏高、重復(fù)性差等缺陷，并且現(xiàn)有的基因芯片技術(shù)不及其他檢測技術(shù)[8]。

本研究采用直接擴增反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈（directly Quantitative reverse transcrip-tase PCR，dRT-qPCR）的檢測技術(shù)，直接將樣本加入反應(yīng)管內(nèi)進行檢測，達到快速、準(zhǔn)確檢測口蹄疫病毒的目的，同時可以節(jié)省成本和降低交叉污染的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

口蹄疫A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的病毒株，均為滅活的細(xì)胞培養(yǎng)毒，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。待測牛血清樣品44份、牛皰疹液樣品28份、豬血清樣品22份、豬皰疹液樣品19份共計113份田間樣品，-80 ℃冰箱保存。所有材料均為深圳市某衛(wèi)生監(jiān)督所贈送的口蹄疫樣品，樣品保存于澳東檢驗檢測科技有限公司研發(fā)實驗室-80 ℃冰箱。

1.2 引物探針設(shè)計

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中的4 000余條口蹄疫病毒的VP1基因序列，選擇口蹄疫病毒VP1基因序列作為檢測的擴增區(qū)域。使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具、DNAStar、PrimerExpress等軟件以及自行設(shè)計編寫的分析軟件設(shè)計特異性的引物和探針序列，分析引物之間的相互作用，優(yōu)化和篩選引物探針組合，最大限度減少反應(yīng)中二聚體的產(chǎn)生，以保證試劑的高特異性、高靈敏度和高基因型覆蓋率。

設(shè)計的引物探針包括上游引物FMD-F、下游引物FMD-R、探針FMD-Pb。其中探針FMD-Pb 5′端標(biāo)記有FAM熒光報告基團，3′端標(biāo)記有BHQ1熒光淬滅基團。設(shè)計的引物探針交由上海基康生物技術(shù)有限公司合成，序列如表1所示。

1.3 樣本處理

采用直接擴增技術(shù)，不需要對核酸樣本進行提取純化。取一定量血清樣本加入3倍體積的甲醇，混勻后靜置5 min，于3 000 r/min離心15 min，取上清液備用；水皰疹液樣本，直接將采集的水皰疹液，于6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.4 擴增反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)最優(yōu)反應(yīng)體系組分的反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀中，對擴增反應(yīng)條件進行探索。

1）病毒RNA釋放及反轉(zhuǎn)錄溫度（50～60 ℃），10～30 min。

2）預(yù)變性溫度（90～95 ℃），5～20 min。

3）變性溫度（90～95 ℃），5～20 s。

4）退火/延伸溫度（60～65 ℃）、退火/延伸時間（30～120 s）、qPCR循環(huán)數(shù)（35～45）。

1.5 dRT-qPCR特異性試驗

應(yīng)用dRT-qPCR檢測方法對口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個亞型的核酸樣本和以DEPC水為樣本的陰性對照，進行檢測以觀察特異性結(jié)果。

1.6 dRT-qPCR分析靈敏度試驗

應(yīng)用dRT-qPCR試劑盒（不提純樣本）和某公司產(chǎn)的試劑盒（提純樣本）對口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本稀釋至10 pg/μL的核酸濃度各40份進行RT-qPCR擴增檢測，觀察分析靈敏度結(jié)果。

1.7 dRT-qPCR樣品檢測試驗

分別采用dRT-qPCR檢測方法和常規(guī)方法對深圳市光明新區(qū)疾病預(yù)防控制中心保存的113份口蹄疫樣本進行檢測，以已知的A型核酸樣本作為陽性對照，DEPC水為樣本作為陰性對照。

1.8 結(jié)果判定

FAM通道均無擴增曲線結(jié)果判定為陰性；FAM通道Ct值≤35.0，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，表示樣本為陽性；病毒檢測結(jié)果的Ct值在35.0

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒組分確定

經(jīng)過摸索，確定了dRT-qPCR的反應(yīng)體系試劑盒?？偡磻?yīng)體系為25 μL，主要包含：12 μL 2×Buffer Mix，2 μL dRT-qPCR 酶混液（Taq酶0.5 μL，M-MLV酶0.4 μL，酶保存液1.1 μL），0.8 μmol/L口蹄疫病毒引物探針混合液（FMD-F∶FMD-R∶FMD-Pb=3∶3∶2），0.4 μmol/L dNTPs，RNA酶抑制劑10 U，5 μL檢測樣本，DEPC水補足至25 μL。

2.2 最優(yōu)反應(yīng)條件確定

確定了最優(yōu)擴增反應(yīng)條件，見表2。熒光信號收集設(shè)定在40循環(huán)的退火/延伸時。

2.3 dRT-qPCR擴增特異性結(jié)果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本和以DEPC水為樣本的陰性對照，25 μL反應(yīng)體系和45循環(huán)（5循環(huán)+40循環(huán)）反應(yīng)程序，擴增時間105 min，特異性檢測結(jié)果如圖1（閾值30 000）所示。從圖1可以看出，口蹄疫病毒7個亞型的核酸樣本都有擴增曲線，陰性對照為水平線，表明用dRT-qPCR方法能夠檢測出口蹄疫病毒7個血清型的核酸樣本，且特異性良好。

2.4 dRT-qPCR分析靈敏度結(jié)果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7個血清型的核酸樣本稀釋至10 pg/μL的核酸濃度40份，用dRT-qPCR試劑盒和某公司試劑盒進行擴增檢測，結(jié)果如表3所示。從表3可知，dRT-qPCR試劑盒和某公司試劑盒對口蹄疫病毒進行擴增檢測。結(jié)果表明，這兩種方法所檢測出的陽性樣本數(shù)差別很小，說明它們具有相一致的分析靈敏度。

2.5 樣本檢測結(jié)果

對113份口蹄疫樣本進行檢測，得到檢測結(jié)果如表4、表5所示。從表4、表5中可以看出，dRT-qPCR檢測出的陽性樣本數(shù)88份，常規(guī)方法檢測出陽性樣本數(shù)84份，常規(guī)方法有可能出現(xiàn)漏檢情況或出現(xiàn)結(jié)果隨機性。結(jié)果表明，dRT-qPCR檢測方法對于樣本檢測可行。

3 小結(jié)與討論

口蹄疫病毒有7個血清型，且每個血清型又有多個不同的亞型，使對口蹄疫病毒的快速檢測非常困難?，F(xiàn)有的病毒分離法、流行病學(xué)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的免疫技術(shù)和ELISA等方法在檢測過程仍有部分缺陷[9]，目前使用較多的方法是核酸檢測技術(shù)，能直觀地反映病毒感染情況[10]，常用于檢測口蹄疫病毒檢測。核酸檢測技術(shù)主要通過RT-qPCR或qPCR方法進行，常規(guī)RT-qPCR或qPCR方法所檢測的樣本都需要經(jīng)過提取純化，但某些特殊樣本會攜帶有肝素、血紅蛋白、鐵血紅蛋白等反轉(zhuǎn)錄酶抑制成分[11]，往往對結(jié)果造成影響；而對于某些低濃度的樣本，可能在純化后提取的樣本量非常少，容易造成陽性漏檢現(xiàn)象，這將對口蹄疫爆發(fā)時期很不利，無法進行實施監(jiān)控[12-14]。

本研究建立的dRT-qPCR方法可以用來檢測病毒核酸樣本，且樣本檢出時間為1.5 h，常規(guī)檢測需要8 h[15]，dRT-qPCR方法大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，且具有快速、準(zhǔn)確、特異、敏感的優(yōu)點，為監(jiān)測口蹄疫疫情以及國內(nèi)各出入境與口岸機關(guān)對于口蹄疫病毒檢疫檢驗提供了一種非常方便的技術(shù)手段。

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