利用RNAi技術(shù)控制害蟲

閘雯俊+李三和+周雷+劉凱+陳志軍，楊國(guó)才，劉++凱+徐華山+李培德+游艾青

摘要：RNAi能夠抑制基因特異序列的表達(dá)，為昆蟲學(xué)的研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害蟲種群以及減少疾病病原體的感染。昆蟲RNAi的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)不同的種群、RNAi的攝入方式、靶標(biāo)基因都會(huì)影響RNAi的效率，這也是轉(zhuǎn)錄本抑制程度存在差異的原因所在。對(duì)于那些不能穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的物種，如昆蟲，利用dsRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)是快速分析基因功能的重要手段。

關(guān)鍵詞：RNAi；害蟲控制；dsRNA

中圖分類號(hào)：S476.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）06-1006-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.002

Abstract： RNA interference（RNAi）， the sequence-specific suppression of gene expression， offers great opportunities for insect science， especially to analyze gene function， manage pest populations， and reduce disease pathogens. The accumulating body of literature on insect RNAi has revealed that the efficiency of RNAi varies between different species， the mode of RNAi delivery， and the genes being targeted. There is also variation in the duration of transcript suppression. Double-stranded RNA（dsRNA） mediated RNAi has emerged as one of the most powerful strategies for the rapid analysis of gene function，particularly in organisms for which stable transgenesis is not available，such as insects.

Key words： RNAi； insect pest control； dsRNA

RNA干擾（RNA interference，RNAi）已經(jīng)徹底改變了昆蟲學(xué)研究的范圍，因?yàn)樗寡芯空吣軌蛞种颇康幕虻谋磉_(dá)，從而將改變的表型和基因功能聯(lián)系起來。對(duì)于基礎(chǔ)研究而言，RNAi為所有的昆蟲基因組學(xué)研究提供了一條路徑，同時(shí)對(duì)應(yīng)用昆蟲學(xué)也有巨大的潛在作用。例如，RNAi能夠通過抑制關(guān)鍵基因提高死亡率來控制害蟲。此外，利用無害的病毒序列來啟動(dòng)抗病毒RNAi反應(yīng)，能夠有效防止益蟲（如蜜蜂和家蠶）感染高致病性病毒。

1 RNAi的機(jī)制

RNAi是利用非編碼的小RNA分子切割靶標(biāo)mRNA來抑制基因的表達(dá)。主要分為以下3個(gè)階段。

1）起始階段。核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以ATP依賴的方式，逐步切割加工導(dǎo)入生物體的外源或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的dsRNA，生成21～23 nt的siRNA（small interfering RNA），其與靶標(biāo)mRNA具有高度特異性，為成功降解提供保證。

2）效應(yīng)階段。siRNA雙鏈結(jié)合其他蛋白復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex RISC），雙鏈siRNA解鏈，RISC介導(dǎo)單鏈反義siRNA通過堿基配對(duì)原則從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，進(jìn)一步降解mRNA，同時(shí)還可以引發(fā)宿主細(xì)胞的一系列反應(yīng)。

3）放大效應(yīng)階段。siRNA在引導(dǎo)RISC切割靶RNA的同時(shí)，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA為模板合成新的dsRNA。緊接著進(jìn)入第一階段循環(huán)過程生成大量次級(jí)的siRNA，經(jīng)過逐級(jí)放大效應(yīng)，使mRNA徹底降解。

2 利用RNAi控制害蟲群體

利用RNAi技術(shù)控制害蟲和保護(hù)馴化的益蟲（例如蜜蜂）已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。一般情況下，RNAi序列適用于任何形式，從單個(gè)基因型到家系甚至昆蟲所屬的目。

2.1 利用RNAi控制害蟲

利用RNAi控制害蟲最早應(yīng)用于玉米根蟲[1]和棉鈴蟲[2]。研究者喂養(yǎng)玉米根蟲含有290條dsRNAs的人工飼料，其中發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因會(huì)使成蟲的生理活動(dòng)下降，并且對(duì)液泡ATP酶亞基A基因（V-ATPase）進(jìn)行了詳細(xì)的分析。人工飼料中只含有低濃度的V-ATPase的dsRNAs，經(jīng)玉米根蟲取食后，相應(yīng)的mRNA也會(huì)受到抑制。更重要的是，研究者將玉米根蟲喂養(yǎng)在表達(dá)V-ATPase dsRNAs的轉(zhuǎn)基因玉米上后，發(fā)現(xiàn)根蟲的V-ATPase基因表達(dá)量下降，玉米根部受損程度降低。研究者發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲有一個(gè)靶標(biāo)基因細(xì)胞色素P450（CYP6AE1），該基因在幼蟲中腸中表達(dá)，對(duì)棉花的二級(jí)次生代謝產(chǎn)物棉子酚具有解毒功能。當(dāng)將棉鈴蟲喂養(yǎng)在表達(dá)CYP6AE14-dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草上時(shí)，該基因在蟲體中腸里的表達(dá)量下降，幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育減速[3]。同時(shí)玉米根蟲和棉鈴蟲也都有了新的研究發(fā)現(xiàn)。其中Snf7基因主要參與膜受體的運(yùn)輸，在玉米根蟲中的效果非常顯著[4]。同時(shí)在棉花中表達(dá)半胱氨酸蛋白酶后，棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)基因植株后，蟲體圍食膜的功能減弱，變得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同時(shí)表達(dá)dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比單一表達(dá)其中一個(gè)基因的抗性要強(qiáng)[5]。

上述研究闡明了利用RNAi控制害蟲有兩個(gè)關(guān)鍵因素：①用于RNAi靶標(biāo)基因序列的選擇。②傳遞dsRNA的方式。其中靶標(biāo)基因必須是昆蟲的關(guān)鍵基因，同時(shí)在昆蟲的整個(gè)生活史中要持續(xù)表達(dá)。隨著技術(shù)從理論證明到應(yīng)用的轉(zhuǎn)變，嚴(yán)苛設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列是必須的。先決條件就是從dsRNA中獲得的21～25 bp siRNAs必須與序列保證完全的一致性，同時(shí)還要與昆蟲的mRNA具有同源性。并且還要與非靶標(biāo)物種的所有siRNAs和編碼蛋白基因具有序列差異性。這些比對(duì)都可以在網(wǎng)上進(jìn)行，將候選的dsRNA同時(shí)與靶標(biāo)物種的目的基因及所有公共基因組中預(yù)測(cè)的編碼蛋白的基因進(jìn)行比對(duì)。要杜絕不能與靶標(biāo)序列完全匹配的siRNAs以及與非靶標(biāo)物種序列匹配的siRNAs。