柔肝顆粒的定性定量方法優(yōu)化研究

陳春鶯，鄒愷平，2，施 敏△

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023）

·實驗研究·

柔肝顆粒的定性定量方法優(yōu)化研究

陳春鶯1，鄒愷平1，2，施 敏1△

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023）

目的補充優(yōu)化柔肝顆粒的薄層色譜（TLC）鑒別及含量測定方法，提高質量標準。方法 采用TLC法對制劑中赤芍、三七、白術進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結果 TLC法鑒定專屬性強，陰性無干擾；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質量濃度在0.981～19.62 αg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，r＝0.999 7（n＝6），平均回收率為 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）。結論 該方法準確、快速、穩(wěn)定、可靠、重復性好，可用于柔肝顆粒的質量控制及評價。

柔肝顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；質量標準

柔肝顆粒由黃芪、赤芍、炒白術、當歸、三七等中藥組方，方中以黃芪為君藥，當歸、白術為臣藥，具有補益肝腎、補氣健脾之功效，為南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院消化科根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，以柔肝健脾、益腎活絡為法擬訂的成方?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪、當歸具有保護肝細胞的作用[1]，赤芍、牛膝、三七也對肝損傷有一定保護和治療作用[2]。有研究表明，柔肝顆粒具有較好的抗實驗大鼠肝纖維化作用，能減輕肝細胞損傷，從而有效地保護肝細胞[3]。柔肝顆粒為醫(yī)院院內(nèi)制劑，其質量標準與新藥要求相去甚遠。本研究中，按新藥審批的技術要求，在柔肝顆粒原質量標準的基礎上，增加了三七、白術的薄層色譜（TLC）鑒別方法，并進行了方法學考察，對原標準中赤芍的鑒別進行了修訂，增加了方中君藥黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定項?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WD-9413A型凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備儀器廠）；KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent1260S型高效液相色譜儀，包括G1312C型二元泵，G1316A型柱溫箱，G1315D型DAD檢測器，Chemstation色譜工作站，G1367E型自動進樣器(美國Agilent公司)；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201304，中國食品藥品檢定研究院）；柔肝顆粒（批號分別為 1607001，1607002，1608003，江蘇省中醫(yī)院制劑部）；赤芍對照藥材（批號為121093-200402）、三七對照藥材（批號為 120941-200506）、白術對照藥材（120925-200407）購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇為色譜純，其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 赤芍

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細，加乙醇10 mL，超聲5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備陰性對照品溶液；取芍藥苷對照藥材粉末0.5 g，按赤芍供試品溶液同法制備，作為對照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法，精密吸取上述3種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性無干擾。詳見圖1。

圖1 赤芍薄層色譜圖譜

2.1.2 三七

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細，加水攪勻，再加水飽和的正丁醇5 mL，振搖，靜置，取上層溶液，加3倍量正丁醇飽和的水，搖勻使分層，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備陰性對照品溶液；取三七對照藥材粉末0.5 g，按三七供試品溶液同法制備，作為對照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法試驗，精密吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品藥材溶液色譜相同位置上顯相同顏色斑點。詳見圖2。

2.1.3 白術

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細，加正己烷15 mL，超聲處理15 min，合并正己烷提取液，揮干，殘渣加5 mL乙醇溶解，作為供試品溶液；同法制得陰性對照品溶液；取白術對照藥材粉末1g，加正己烷4mL，超聲15min，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，精密吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（2∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈365 nm波長下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。詳見圖3。

圖2 三七薄層色譜圖

圖3 白術薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Hedera ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：流動相A為0.2%甲酸溶液，流動相B為乙腈，按表1進行梯度洗脫；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL。

分別精密吸取2.2.2項下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，結果陰性對照無干擾。色譜柱的理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算應不低于3 000，分離度大于1.5。結果見圖4。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品9.81 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇適量，溶解，并稀釋至刻度，作為貯備液；精密吸取貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，稀釋至刻度，即得。

圖4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷高效液相色譜圖

供試品溶液：稱取樣品約1.0 g，研細后精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲15 min（功率280 W，頻率53 kHz），加甲醇，稀釋到刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：取黃芪的缺味陰性制劑，依法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，分別稀釋成質量濃度為 0.981，1.962，2.452，4.905，9.810，19.620 μg／mL的溶液，精密吸取不同質量濃度的對照品溶液各10 μL，測定峰面積積分值，以質量濃度(X，μg／mL)對峰面積積分值(Y)進行線性回歸，得回歸方程 Y＝30.199 X-0.183 9，r＝0.999 7 (n＝6)。結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度在0.981～19.620 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關系良好。詳見表2。

精密度試驗：精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定，記錄峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品峰面積的 RSD＝0.40＜5%(n＝6)，表明儀器精密度良好，詳見表3。

重復性試驗：按處方量平行稱取同一批樣品共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣，測定。結果樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為4.40 μg／mL，RSD＝0.46%＜5%(n＝6)，表明方法重復性良好。詳見表4。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性關系考察結果(n＝6)

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷日內(nèi)精密度考察結果（n＝6）

表4 重復性試驗結果（n＝6）

穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，計算峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的 RSD＝2.19%＜5%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。詳見表5。

加樣回收試驗：稱取柔肝顆粒（批號為1607002）2 g，精密稱定，共6份，置50 mL容量瓶中，精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，加甲醇定容至刻度，搖勻，過膜，進樣測定，并計算回收率。結果見表6。

表5 穩(wěn)定性試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取不同批號柔肝顆粒（批號分別為 1607001，1607002，1608003），依法制備供試品溶液，每批取3份，依法進樣測定。結果見表7。

3 討論

本研究對方中多味藥材進行了薄層色譜鑒別，由于藥材種類較多，中藥飲片的成分復雜，不同藥材可能含有相同的化學成分，僅以化學成分對照品為參考，特別是該成分為其非專屬性成分時，難以作為飲片的定性鑒別依據(jù)。故本研究中建立的TLC鑒別方法使用對照藥材作為參考，增強了定性鑒別的準確性與可靠性。

表6 加樣回收試驗結果（n＝6）

表7 3批柔肝顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定結果

本制劑功能柔肝健脾、活血通絡，用于肝硬化之正氣虧虛、肝脾血瘀證。黃芪為方中君藥，主要含皂苷類、黃酮及其苷類和多糖類成分[4-5]。黃酮類成分有改善血循環(huán)和提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷活性較高，為主要有效成分，有抗病毒、抗菌、調(diào)血脂、抗氧自由基等作用，還有抗缺血和改善血常規(guī)作用[6]?，F(xiàn)在多采用HPLC法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量[6-8]。本研究中所建立的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法，經(jīng)方法學考察表明，其專屬性強，重復性好，可用于柔肝顆粒的質量控制。黃芪甲苷作為藥材黃芪的質量評價指標之一，其檢測方法多采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）法，由于樣品處理方法復雜，含量測定穩(wěn)定性差，故不作為黃芪含量的測定方法。

本研究中對柔肝顆粒原質量標準進行了優(yōu)化，對赤芍的鑒別進行了方法學研究，建立了三七、白術的TLC鑒別方法和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC含量測定法。以上3味藥材的薄層色譜定性鑒別，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的定量研究，經(jīng)3批樣品驗證考察，方法專屬性強，陰性無干擾，靈敏度高，重復性好。通過定性和定量2種方法的結合，可更科學、合理、全面地進行質量評價，故可作為該制劑質量標準制訂的可靠依據(jù)。

[1]吳希美，謝強敏，唐法娣，等.疏舒膠囊對實驗性肝損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2001，17（2）：31-33.

[2]邵春忠，任 健，趙素蘭，等.抗肝纖維化中藥篩選研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17（2）：27-29.

[3]朱萱萱，董 筠，張忠華，等.柔肝顆粒對改良CCL4法致大鼠肝硬化的治療作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（6）：426-429.

[4]肖培根.新編中藥志（第一卷）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2002：876.

[5]羅春霞，林平川，谷麗華，等.高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮 -7-O-α-D-葡萄吡喃糖苷的含量[J].中國中藥雜志，2003，28（7）：603-606.

[6]劉書芬，梁倩倩，陳 巖，等.HPLC法同時測定防己黃芪湯中5種成分[J].中成藥，2014，36（11）：2312-2315.

[7]楊巧虹，萬萌萌，白夢娜，等.高效液相色譜法測定糖腎寶顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量[J].中國藥業(yè)，2015，24（16）：85-87.

[8]劉 玲，趙曉莉，狄留慶，等.采用體外腸道菌群實驗研究防風對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝的影響[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2015，31（2）：170-173.

Improvement of Qualitative and Quantitative M ethods for Rougan Granules

Chen Chunying1，Zou Kaiping1，2，Shi Min1
（1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029； 2.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210023）

Objective To impove the quality standard of Rougan Granules.M ethods Thin layer chromatography（TLC）method was used to identify Radix Paeoniae Rubra，Notoginseng and Atractylodes in Rougan Granules.The content of calycosin-7-glucoside was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）method.Results The TLC spots were clear with strong specificity and free of interference of negative samples.The linear range of calycosin-7-glucoside was 0.981-19.62 μg／mL，r＝0.999 7（n＝6）.The average recovery rate of calycosin-7-glucoside was 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）.Conclusion The method is accurate，rapid，reliable，and stable with good repeatability，it can be used to control and evaluate the quality standard of Rougan Granules.

Rougan Granules；TLC；HPLC；calycosin-7-glucoside；quality standard

R284.1；R256.4

A

1006-4931(2017)06-0015-05

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.005

陳春鶯，女，主管中藥師，研究方向為醫(yī)院制劑質量控制，（電話）025-86614204。

△通訊作者：施敏，女，副主任中藥師，研究方向為醫(yī)院制劑質量控制，（電子信箱）romantic.fieworks＠163.com。