小半夏加茯苓湯醇提物對BGC—823細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響

閆文娟+賈亞玲+陳麗麗+何前松+馮泳

【摘要】目的： 觀察小半夏加茯苓湯醇提物對胃癌細(xì)胞BGC-823的凋亡作用以及誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生的機(jī)制。方法：運(yùn)用MTT法檢測不同濃度的小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823的增殖抑制作用并計(jì)算抑制率；以羅丹明123為細(xì)胞染色劑，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位的改變；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Bax、Bcl-2和Cyt-c表達(dá)的變化。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823具有抑制作用，隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長，抑制率逐漸升高，細(xì)胞活力逐漸減弱，與空白對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，小半夏加茯苓湯醇提物能夠顯著降低線粒體跨膜電位（P<001）；qRT-PCR結(jié)果顯示，Bax基因表達(dá)顯著升高（P<001），Cyt-c基因表達(dá)升高（P<005），Bcl-2基因的表達(dá)降低（P<005）。結(jié)論：小半夏加茯苓湯醇提物可以抑制BGC-823細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減小Bcl-2/Bax基因表達(dá)比例，增強(qiáng)Cyt-c基因表達(dá)，其機(jī)制可能與線粒體為核心的凋亡通路相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】小半夏加茯苓湯；胃癌細(xì)胞BGC-823；凋亡；線粒體；

【中圖分類號】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0042-04

胃癌作為常見的消化道系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在中國排名第三[1]。胃癌的治療方法包括手術(shù)、放療、化療，但放化療引起的惡心、嘔吐、食欲不振等消化道反應(yīng)，如果未得到有效的控制，將降低胃癌患者的依從性及生存質(zhì)量而放棄治療。小半夏加茯苓湯（Xiao Banxia plus Fuling Decoction，XBFD）源于《金匱要略》，全方由半夏、生姜、茯苓組成，現(xiàn)代研究證實(shí)半夏、生姜、茯苓三味藥均有不同程度的抗腫瘤作用[3-5]。具有散飲降逆、和胃止嘔的作用，臨床上對于化療所致的遲發(fā)性嘔吐癥狀有明顯療效，較甲氧氯普安療效更好[2]。在辨證論治痰證腫瘤時(shí)亦常用到半夏、生姜、茯苓三味藥，為了進(jìn)一步明確小半夏加茯苓湯復(fù)方抗腫瘤的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞BGC-823為對象，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR，RT-qPCR）等方法，檢測線粒體跨膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP）以及相關(guān)基因表達(dá)的變化。

1材料與儀器

11材料與試劑人胃癌細(xì)胞BGC-823系購自上海細(xì)胞庫。小半夏加茯苓湯醇提物（取生半夏18g，茯苓9g，生姜15g，50%乙醇于85℃水浴鍋中提取，搖勻，干燥后稱取15g小半夏加茯苓湯醇提物干粉，用50mL 50%乙醇溶解，得30mg/mL母液，稀釋后使用[6]）、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、磷酸鹽緩沖液均購自美國Hyclone公司、胎牛血清購自美國Gibco公司、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123）均購自美國Sigma公司、Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司、RNA提取試劑盒購自天根生化公司、Thermo ScientificMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 購自 Thermo Scientific公司、引物由上海生工公司合成。

12主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermofisher，USA）、低溫高速離心機(jī)（Beckman Coulter，USA）、多功能酶標(biāo)儀（BioTek Synergy H4，USA）、流式細(xì)胞儀（BD，USA）、NanoDrop2000（Thermofisher，USA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI ViiA7TM Dx Fast，USA）。

2方法

21細(xì)胞培養(yǎng)和分組BGC-823細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為小半夏加茯苓湯醇提物組（800μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400μg/mL），同時(shí)設(shè)不加藥物的完全培養(yǎng)液為空白對照組和乙醇溶劑對照組。分別檢測12、24h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

22MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞BGC-823以6×104/孔接種于96孔板，預(yù)先設(shè)定調(diào)零組、空白對照組、乙醇溶劑對照組和給藥組，給藥組分別加入不同濃度的XBFD醇提物，乙醇溶劑對照組加入與800μg/mL實(shí)驗(yàn)組等量的50%乙醇，每個(gè)組至少設(shè)三個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)12h、24h后，每孔加入200μl 含濃度為5mg/mL MTT的培養(yǎng)液，37℃孵育4h后，棄液后加入DMSO 150μl，振蕩器充分振蕩后以490nm波長測定各孔吸光度（OD），并記錄結(jié)果計(jì)算抑制率。抑制率=[1-（給藥組OD值-調(diào)零組OD值）/（空白組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。

23流式細(xì)胞術(shù)檢測（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）MMP的改變?nèi)?shù)生長期的BGC-823細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)實(shí)驗(yàn)組為終濃度600μg/mL的XBFD醇提物溶液，空白對照組加入與實(shí)驗(yàn)組等量的50%乙醇，相同的條件下分別培養(yǎng)12h，24h。收集上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3遍，收集洗滌液，按AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，并加入5μlRh123染色，常溫避光孵育10-30min后，上流式細(xì)胞儀檢測，每個(gè)樣本檢測10000個(gè)細(xì)胞，測定相對熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度的變化表示線粒體膜電位的變化。

24qRT-PCR法檢測bax、Bcl-2和細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt-c） mRNA的相對表達(dá)量收集并提取經(jīng)600μg/mL的XBFD醇提物處理24h后的BGC-823細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2μL cDNA模板，2×SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 10μL，水9μL，上下游引物各075μL。引物設(shè)計(jì)詳見表1。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為：50℃2min，95℃10min，（95℃ 15sec，60℃ 30sec，92℃ 30sec）×40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，根據(jù)qRT-PCR檢測結(jié)果，分析得出各個(gè)樣品量的循環(huán)閾值（Ct），以β-actin作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)設(shè)有 3 次重復(fù)，采用2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對定量分析。

25統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS230軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，各組間差異采用One-Way ANOVA分析，P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31不同濃度XBFD醇提物對胃癌細(xì)胞增殖的影響不同濃度的XBFD醇提物作用于胃癌細(xì)胞系BGC-823后，胃癌細(xì)胞增殖抑制率見表2，圖1。圖1顯示XBFD醇提物對BGC-823細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)“濃度-時(shí)間依賴性”的關(guān)系，即隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，細(xì)胞活力逐漸減弱，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001）。

32XBFD醇提物對BGC-823 MMP的影響XBFD醇提物作用BGC-82312h、24h后，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度顯著高于空白對照組（見表3，圖2），提示MMP明顯降低，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）。

33XBFD醇提物對BGC-823凋亡相關(guān)基因bax、Bcl-2和Cyt-c基因的影響采用qRT-PCR方法，檢測600μg/mL的小半夏加茯苓醇提物干預(yù)BGC-823 24h后，細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2和Cyt-c基因相對表達(dá)量的變化。Bax基因檢測結(jié)果表明與空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Bax基因相對表達(dá)量變化明顯升高（P<001），Cyt-c基因相對表達(dá)量變化升高（P<005）；Bcl-2相對表達(dá)量變化降低（P<005）（見表4）。

4討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃癌屬于“胃反”、“噎嗝”、“胃脘痛”、“積聚”、“伏梁”等癥的范疇，其病機(jī)與脾胃虛弱、痰濁阻滯有關(guān)[7]。痰飲與腫瘤關(guān)系密切[8]，諸多醫(yī)家提倡腫瘤當(dāng)“從痰飲論治”[9]，“當(dāng)以溫藥和之”[10]。痰飲的治療大法首載于《金匱要略》，并用小半夏加茯苓湯作為治療痰飲的名方。小半夏加茯苓湯用于臨床的止嘔研究較多，但對抗腫瘤作用機(jī)理的研究較少。本課題組前期研究表明，該復(fù)方對于腫瘤細(xì)胞有促凋亡和提高機(jī)體免疫力的作用。楊長福等[11]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓湯可抑制HepG2細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡，機(jī)制可能通過激活caspase-3蛋白表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于S期，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。何前松等[12]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓顆粒含藥血清可下調(diào)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)，抑制細(xì)胞生長增殖，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞毒作用有關(guān)。蔡琨等[13]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓顆?？稍鰪?qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能，抑制模型鼠腫瘤的生長，具有一定的腫瘤抑制及免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)以BGC-823為研究對象，采用小半夏加茯苓湯醇提物用于體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823細(xì)胞具有增殖抑制作用，并且呈現(xiàn)出明顯的量效時(shí)效關(guān)系。

細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括內(nèi)源途徑（又稱線粒體凋亡途徑）、外源途徑（又稱死亡受體凋亡途徑）以及非依賴caspase凋亡途徑[14]。在細(xì)胞接受凋亡信號后，線粒體膜電位降低可以使線粒體內(nèi)釋放一系列凋亡因子可引起如Cyt-c和Apaf-1等到細(xì)胞質(zhì)中， 激活下游的caspase家族， 促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇羅丹明123染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱或消失，而在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體膜完整性被破壞，引起線粒體跨膜電位的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光[16]。FCM結(jié)果顯示，給藥組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示XBFD醇提物能夠降低線粒體跨膜電位，說明XBFD醇提物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡其中途徑之一可能與損傷腫瘤細(xì)胞的線粒體相關(guān)。

Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要因子，與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)[17]。正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號時(shí)，Bax能自身形成同源二聚體（Bax/Bax）促進(jìn)Cyt-c的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2位于線粒體外膜，Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體（Bcl-2/Bax）以抑制細(xì)胞凋亡。因此Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵因素。當(dāng)Bcl-2/Bax值降低時(shí)，細(xì)胞凋亡趨勢增加[19]。本實(shí)驗(yàn)中促凋亡基因Bax在小半夏加茯苓湯誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞BGC-823中的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比例減小，使線粒體膜電位降低，通透性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和Cyt-c被大量釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致BGC-823細(xì)胞啟動(dòng)線粒體途徑發(fā)生凋亡。

因此，小半夏加茯苓湯對人胃癌BGC-823細(xì)胞有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與線粒體損傷同時(shí)伴隨下調(diào)Bcl-2/Bax比例，促進(jìn)Cyt-c大量釋放有關(guān)。但細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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