瑤藥崗松抗佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

趙會(huì)勤+李超杰+徐玉潔+賈奧+賈貝西+賈成軍

【摘要】目的：觀察瑤藥崗松根醇提物（BFTE）對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）的藥理作用。方法：42只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤多苷組及BFTE高、中、低劑量組，完全弗氏佐劑誘導(dǎo)AA后，于第12天開始連續(xù)灌胃給藥16d；同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、免疫器官指數(shù)；第29天處死大鼠，酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化。結(jié)果：與模型組相比，BFTE能夠顯著抑制AA大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性足跖腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎評(píng)分、免疫器官系數(shù)，改善大鼠踝關(guān)節(jié)病理狀態(tài)，下調(diào)AA大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。結(jié)論：BFTE對(duì)AA大鼠具有良好的治療作用，其抗炎免疫的機(jī)理可能與減少TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】瑤藥；崗松；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；佐劑性關(guān)節(jié)炎；炎癥因子

【中圖分類號(hào)】R2827【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）05-0037-05

桃金娘科植物崗松（Baeckea frutescens L）為廣西瑤族民間習(xí)用藥材，盤瑤語(yǔ)稱“樸老中”，產(chǎn)于我國(guó)的南部地區(qū)，全株均可入藥，具有化瘀止痛、清熱解毒、利尿通淋、殺蟲止癢的功效，臨床用于感冒高熱、黃疸型肝炎、胃痛、腸炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腳氣病、膀胱炎、小便不利等[1-2]。目前，崗松資源的開發(fā)利用僅以地上部分（枝葉）所含揮發(fā)油為主，而對(duì)地下部分（根）的研究報(bào)道較少。課題組對(duì)崗松根進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化學(xué)研究，分離鑒定Baeckeins A-I共9個(gè)新化合物[3-6]，并進(jìn)行初步的抗炎活性評(píng)價(jià)。本研究在前期基礎(chǔ)上，結(jié)合民間用藥習(xí)慣及文獻(xiàn)資料記載，擬對(duì)崗松根醇提物抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的藥理作用開展研究，并在細(xì)胞水平探討其可能的作用機(jī)制。

1材料與儀器

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購(gòu)自購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（豫）2011-0001。

12藥品與試劑瑤藥崗松采自廣西南寧，經(jīng)廣西民族醫(yī)藥研究院戴彬主任醫(yī)師鑒定為Baeckea frutescens L的根，經(jīng)95%乙醇提取、回收溶劑得總浸膏（BFTE），使用時(shí)用05% CMC-Na溶液的配制成所需濃度。雷公藤多苷片（上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司）；完全弗氏佐劑（CFA，美國(guó)Sigma公司）；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒和IL-1β ELISA 試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）；甲醛（天津市風(fēng)船試劑科技有限公司）。

13儀器電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；外徑千分尺（Radio Shack Corporation）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）。

2方法

21AA大鼠模型的制備及分組給藥從4 ℃冰箱中取出CFA，充分振蕩、混勻；將大鼠右后肢拉直，用75%的酒精消毒，使用l mL注射器于大鼠足跖皮內(nèi)注射015 mL CFA致炎，正常對(duì)照組大鼠注射等體積的生理鹽水[7-9]。將42只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、崗松根醇提物高（BFTE-H）、中（BFTE-M）、低（BFTE-L）劑量組，每組7只；于造模后第12天開始灌胃給藥，連續(xù)給藥16 d；雷公藤多苷組給予雷公藤多苷10 mg/kg，BFTE-H、BFTE-M、BFTE-L組分別給予BFTE 60、30、15 g生藥/kg/d，正常組及模型組給予等量的05% CMC-Na溶液。

22足趾腫脹度于造模前及造模后12、24、36、48h用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠右后足跖厚度，以致炎前后的差值作為大鼠的足趾腫脹度（即足趾腫脹度=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度）[10-11]，以后每4 d測(cè)量一次（即4、8、12、16、20、24、28d），觀察AA大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性足跖腫脹。

23關(guān)節(jié)炎指數(shù)大鼠炎癥出現(xiàn)后，每隔4d觀察并記錄病變程度。病變程度按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)：0分-無(wú)紅腫，1分-關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹，2分-關(guān)節(jié)中度紅腫，3分-關(guān)節(jié)重度紅腫，4分-關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹并伴有功能障礙；累計(jì)大鼠各個(gè)關(guān)節(jié)的評(píng)分和即為關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每只大鼠最多評(píng)16分[12]。

24細(xì)胞因子大鼠繼續(xù)給藥至28d，禁食但不禁水12 h，于第29天稱量各組大鼠的體重，用20%烏拉坦（20g/100 mL）腹腔注射麻醉（06mL/100g），腹主動(dòng)脈取血，凝血后離心分離血清，按照試劑盒說(shuō)明，采用ELISA法分別測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-1β的含量[13]。

25免疫器官系數(shù)于第29d大鼠取血后，摘除胸腺和脾，用生理鹽水沖洗后，用濾紙吸除多余的水分，電子天平稱重，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/體重（g））[14]。

26病理切片第29天處死各組大鼠，取下包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個(gè)右足爪，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，使用10%EDTA脫鈣完全后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）[15]，在高倍顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化。

27統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS190軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果與討論

31BFTE對(duì)AA大鼠原發(fā)性足趾腫脹的影響與正常組相比，各組大鼠右側(cè)足跖腫脹明顯（P< 001），除正常組以外的其它各組間大鼠足跖腫脹無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯示造模成功（見表1）。于造模第12天開始灌胃給藥，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組在給藥12d和16d（即造模24d和28d）后能有效減輕大鼠原發(fā)足跖腫脹程度；造模28d時(shí)，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H和BFTE-L組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005），BFTE-M組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001）；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005），而BFTE各劑量組間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）（表2）。由此可見，BFTE能夠顯著降低AA大鼠原發(fā)性足趾腫脹，BFTE-M組效果最好。

32BFTE對(duì)AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹的影響除正常組外的各組大鼠，于造模后第12天出現(xiàn)繼發(fā)性左后足跖腫脹，第16天達(dá)到高峰。與正常組相比，第12天開始各組大鼠均出現(xiàn)明顯的足跖腫脹（P<005）；給藥12d（即造模24d）后，雷公藤多苷組和BFTE各劑量組能夠顯著降低AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹程度（P<005）；給藥16d（即造模28d）后，各給藥組大鼠繼發(fā)性足趾腫脹程度繼續(xù)降低，與模型組相比，均具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001）；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005），而BFTE各組間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。表明BFTE對(duì)AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹具有顯著的抑制作用，且BFTE-M組作用最強(qiáng)。見表3。

33BFTE對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響模型組大鼠于造模12h后原發(fā)側(cè)足跖急速腫脹，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升至3左右；8d后腫脹向膝關(guān)節(jié)蔓延，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升至4左右；12d繼發(fā)側(cè)足跖開始出現(xiàn)腫脹，且大鼠前趾也開始出現(xiàn)紅腫，關(guān)節(jié)炎指數(shù)有大幅度提升；隨病程延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)持續(xù)升高，24d達(dá)到高峰。20d時(shí)各給藥組大鼠的原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足跖腫脹開始降低，前爪足趾紅腫也有所減輕；28d時(shí)，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001），而與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005），表明BFTE能顯著改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀。見表4。

34BFTE對(duì)AA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著增高（P<001）；與模型組相比，BFTE各劑量組對(duì)AA大鼠血清中的IL-1β和IL-6均具有極顯著的抑制作用（P<001），BFTE-M和BFTE-L組對(duì)TNF-α也具有顯著作用（P<005）；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H和BFTE-M組對(duì)大鼠血清中IL-1β的抑制作用顯著（P<005）（見表5）。由此可見，BFTE在降低AA大鼠血清中的IL-1β方面更為突出，其作用優(yōu)于陽(yáng)性藥雷公藤多苷，且量效關(guān)系明顯。

35BFTE對(duì)AA大鼠免疫器官系數(shù)的影響與正常組相比，模型組大鼠的脾系數(shù)和胸腺系數(shù)均顯著升高（P<005）；與模型組相比，BFTE-M和BFTE-L組的脾系數(shù)和胸腺系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005），而BFTE-H組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。表明BFTE對(duì)AA大鼠免疫器官具有保護(hù)作用，但BFTE-L組效果較好。見表6。

36BFTE對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響大鼠踝關(guān)節(jié)病理檢查顯示：正常組大鼠滑膜上皮規(guī)整、單層排列，軟骨光滑清晰，關(guān)節(jié)腔內(nèi)清晰、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠滑膜有組織增生和炎性細(xì)胞的滋潤(rùn)，且軟骨有一定的剝落；給予雷公藤多苷或不同劑量的BFTE治療后，大鼠的滑膜組織增生、軟骨破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度的減輕。見圖1。

4討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠是一種免疫性炎癥模型，是篩選和評(píng)價(jià)抗風(fēng)濕藥常用的模型之一，其發(fā)病機(jī)制和病理表現(xiàn)與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類似；該模型造模簡(jiǎn)單易行、周期短、重復(fù)性好，被認(rèn)為是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最為理想的模型之一。研究表明，炎性細(xì)胞因子在RA發(fā)病過(guò)程中起重要作用，尤其是參與炎癥的全過(guò)程，加重炎性反應(yīng)；TNF-α與IL-1β是促炎性細(xì)胞因子，常同時(shí)合成分泌，被稱為姊妹細(xì)胞因子；TNF-α刺激IL-6和IL-1β的釋放，致使炎癥反應(yīng)加重，并且能促進(jìn)滑膜及內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞因子的產(chǎn)生，破壞滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，引起滑膜增生、軟骨的破壞；IL-1β誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的增值，致使關(guān)節(jié)損壞；IL-6不僅增強(qiáng) IL-1β和TNF-α的效應(yīng)，還能促進(jìn)類風(fēng)濕因子的合成。

本研究基于AA大鼠模型，對(duì)瑤藥崗松根的醇提物進(jìn)行抗風(fēng)濕活性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，崗松根能夠顯著減輕AA大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性足趾腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)、保護(hù)免疫器官，改善大鼠踝關(guān)節(jié)的病理狀態(tài)，下調(diào)AA大鼠血清中炎癥因子水平，顯示出良好的抗炎免疫作用，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，其作用機(jī)制可能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、減少IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌；本研究通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了崗松根的抗風(fēng)濕效用，該研究可為瑤藥崗松的資源開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]盧文杰，劉布鳴，牙啟康，等.中藥崗松的研究概況[J].廣西醫(yī)學(xué)，2008，30（10）：1517-1519.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：625-626.

[3]Jia BX，Yang J，Chen XQ，et al. Baeckeins A and B， two novel 6-Methylflavonoids from the roots of Baeckeafrutescens[J]. HelvChimActa，2011，94（12）：2283-2288.

[4]Jia BX，Zhou YX，Chen XQ，et al. Structure determination of baeckeins C and D from the roots of Baeckeafrutescens[J]. MagnResonChem，2011，49（11）：757-761.

[5]Jia BX，Ren FX，Jia L，et al. Baeckein E， a new bioactive C-methylated biflavonoid from the roots of Baeckeafrutescens[J]. Nat Prod Res，2013，27（22）：2069-2075.

[6]JiaBX，ZengXL，RenFX，et al. Baeckeins F–I， four novel C-methylated biflavonoids from the roots of Baeckeafrutescensand their anti-inflammatory activities[J]. Food Chem，2014，155：31-37.

[7]張?chǎng)暲?，周玲玲，?不同比例甘草配伍祖師麻抗大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，2014，45（10）：1418-1426.

[8]國(guó)林，黃海瀟，謝玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（2）：121-123.

[9]闞晶，李俊，馮利杰.苦參素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（11）：1348-1351.

[10]張薇，李濤，李萍，等.祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)骨傷，2009，22（11）：848-851.

[11]楊艷麗，陳超.香椿子總多酚對(duì)佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（12）：1073-1077.

[12]盧振華，廖矛川，王麗君，等.江南牡丹草總生物堿對(duì)大白鼠佐劑關(guān)節(jié)炎繼發(fā)腫脹及血沉升高治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18（11）：4-6.

[13]趙春穎，劉永平，馬帥，等.赤雹根總皂苷對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清及足TNF-α，IL-1β，IL-6水平的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（2）：34-38.

[14]孫響波. 馬錢子配伍蘇木對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫作用機(jī)理的研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[15] 李歸浦.厚殼貽貝脂溶性提取物的制備和抗關(guān)節(jié)炎效果及其作用機(jī)理研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.