γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞在H1N1重癥感染小鼠肺臟中的分布及其與肺臟免疫損傷的關(guān)系①

薛春雪 溫銘杰 劉 萌 張須龍 曹 彬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院,北京100020)

·臨床免疫學(xué)·

γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞在H1N1重癥感染小鼠肺臟中的分布及其與肺臟免疫損傷的關(guān)系①

薛春雪 溫銘杰②劉 萌③張須龍②曹 彬④

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院,北京100020)

目的：探討γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞在H1N1重癥感染小鼠肺臟中的分布及其與肺組織炎性損傷的關(guān)系。方法：通過滴鼻感染建立H1N1重癥感染小鼠模型；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞的比例和數(shù)目；采用ELISA和Luminex多因子試劑盒檢測肺泡灌洗液(BALF)中IL-17A、IL-1β、IL-23的濃度和血清中IL-17A 的濃度。結(jié)果：①建立了H1N1重癥感染小鼠模型；②感染后第3天小鼠肺臟中γδT細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例較對照組顯著升高(P<0.01)，而Th和Tc細(xì)胞的比例較對照組無明顯差異；③感染后第1天肺臟中γδT17細(xì)胞占總γδT細(xì)胞的比例和數(shù)目較對照組顯著升高(P<0.05)；Th17和Tc17細(xì)胞占Th和Tc細(xì)胞的比例和數(shù)目較對照組也升高；其中γδT17細(xì)胞的數(shù)目顯著高于Th17和Tc17細(xì)胞(P<0.05)；④感染后小鼠BALF中IL-17A的濃度逐漸升高，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)；感染后第3天血清中IL-17A也顯著升高(P<0.05)；BALF中可能參與γδT17細(xì)胞活化的IL-1β和IL-23的濃度較對照組顯著升高。結(jié)論：γδT17細(xì)胞有可能以γδTCR非依賴的作用方式活化，并通過釋放IL-17A參與H1N1重癥感染小鼠早期肺組織炎性損傷過程。

γδT細(xì)胞;H1N1;重癥流感;IL-17A

新型甲型H1N1流感病毒有很高的致病性，通常患者多表現(xiàn)為輕癥，與普通流感相似；但部分重癥患者病情進(jìn)展迅速，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征、呼吸衰竭和多器官功能衰竭等并發(fā)癥甚至死亡，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。尸檢病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肺臟組織內(nèi)彌漫性肺泡損傷，肺間質(zhì)、細(xì)支氣管壁等大量炎性細(xì)胞浸潤[2]。研究表明：細(xì)胞因子風(fēng)暴是H1N1重癥感染乃至患者死亡的重要原因[3,4]，其中IL-17A是一類重要的促炎因子，能夠募集活化多種免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，對包括肺臟在內(nèi)的多種靶器官產(chǎn)生免疫病理損傷[5]。目前已知產(chǎn)生IL-17A的適應(yīng)性免疫細(xì)胞主要包括CD4+Th17細(xì)胞和CD8+Tc17細(xì)胞[6-8]；產(chǎn)生IL-17A的固有樣淋巴細(xì)胞主要包括γδT細(xì)胞和NKT細(xì)胞，其中γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A的數(shù)量甚至超過Th17細(xì)胞[9-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)H1N1重癥感染小鼠：①肺組織中γδT細(xì)胞比例和數(shù)目明顯增多；②經(jīng)IL-17A中和抗體干預(yù)后，其肺組織損傷減輕，存活期延長[12]。據(jù)此，課題組對H1N1重癥感染小鼠肺組織中可能產(chǎn)生IL-17A 的T細(xì)胞，即γδT17細(xì)胞，CD4+Th17細(xì)胞和CD8+Tc17細(xì)胞的比例、數(shù)目及其產(chǎn)生IL-17A 的動態(tài)變化，以及肺組織中可能參與γδT17細(xì)胞活化的細(xì)胞因子及其濃度進(jìn)行了檢測?，F(xiàn)將初步研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，體重14～16 g；新型甲型H1N1流感病毒(A/California/07/2009)均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 H1N1重癥感染小鼠模型的建立 BALB/c小鼠隨機分為模型組和正常對照組。模型組小鼠麻醉后取106TCID50/ml H1N1病毒液50 μl滴鼻感染；正常對照組小鼠用等量磷酸鹽緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)滴鼻。每日觀察并記錄小鼠體征、體重變化及其生存率。

1.2.2 血清、支氣管肺泡灌洗液和肺臟的收集 小鼠麻醉后摘除眼球取血，室溫30 min凝固后1 500 r/min 4℃離心5 min，收集血清-80℃凍存?zhèn)溆?。BALF制備如下：① 小鼠腹部向上固定四肢，用75%乙醇消毒后分離頸部皮膚肌肉，行氣管切開和導(dǎo)管插入；② 取預(yù)冷PBS 1 ml 經(jīng)導(dǎo)管注入小鼠支氣管肺泡，灌洗2次后回收灌洗液；③1 500 r/min 4℃離心5 min，收集上清液-80℃凍存?zhèn)溆?。開胸取小鼠完整肺臟置于平皿中，用PBS 清洗后取左肺制備石蠟切片用于HE染色，取右肺制備細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞檢測。

1.2.3 肺組織切片制備和HE染色 取小鼠左肺同一部位組織切塊，將其用10%多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋，制備4 μm組織切片，經(jīng)脫蠟、梯度水化后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.4 肺組織單個核細(xì)胞懸液的制備 方法簡述如下：①將剪切成1 mm3碎塊的右肺組織置于含有0.1%膠原酶Ⅰ的DMEM消化液中，在37℃恒溫?fù)u床(200 r/min)消化60 min后，輕輕吹打收集含分散細(xì)胞的消化液；②經(jīng)200目不銹鋼絲網(wǎng)過濾，1 260 r/min離心15 min，棄上清；③用40% Percoll溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀，將上述細(xì)胞懸液輕輕置于70% Percoll溶液上，室溫1 260 r/min離心30 min(升速6，降速2)；④收集白膜層細(xì)胞，用PBS洗滌2次后加入適量PBS制成單個核細(xì)胞懸液。

1.2.5 γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞的檢測 ①將上述單個核細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為2.0×106個/管； ②加入Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlugTM(BD Phar mingen)于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育刺激4 h；③加入抗Fc受體抗體(BD Phar mingen)冰上避光孵育10 min；④ 根據(jù)實驗所需加入以下熒光標(biāo)記抗體：anti-CD3-BV510、anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-PE、anti-CD8a-PerCP-Cy5.5(BD Phar mingen)，anti-TCRβ-PE-Cy7(eBioscience)，anti-TCRγ/δ-APC(Biol-egend)進(jìn)行胞外染色，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次；⑤采用BD Cytofix/CytopermTM(BD Phar mingen)固定劑和破膜劑處理后，加入anti-IL-17A-PE-Cy7(eBioscience)進(jìn)行胞內(nèi)染色，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次后加入300 μl PBS重懸細(xì)胞，BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 BALF 和血清中IL-17A、IL-1β和IL-23濃度的檢測 按照IL-17A ELISA試劑盒(Abcam)說明書，檢測BALF和血清中IL-17A的濃度；按照Luminex多因子檢測試劑盒(Bio-Rad)說明書，檢測BALF中IL-1β和IL-23的濃度。

2 結(jié)果

2.1 H1N1重癥感染小鼠模型的建立 用106TCID50/ml H1N1流感病毒液50 μl滴鼻感染，小鼠出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、食欲減退等癥狀；體重逐日減輕，在感染第5天體重下降26.31%(圖1A)，感染第7天小鼠全部死亡(圖1B)。取正常對照組小鼠和感染后第1、2、3、5、7天小鼠肺組織制備石蠟切片，HE染色發(fā)現(xiàn)：正常對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤；感染小鼠肺組織可見支氣管、血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管腔內(nèi)充血，肺泡上皮細(xì)胞脫落、壞死，肺泡腔塌陷。上述肺組織損傷嚴(yán)重程度隨時間進(jìn)展逐漸加重，并出現(xiàn)病灶擴大、融合等病理改變(圖1C)。上述所見表明，H1N1重癥感染小鼠模型成功建立。

2.2 感染后不同時間點γδT/CD4+Th/CD8+Tc細(xì)胞在肺組織中的分布 取肺組織單個核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞占肺臟總淋巴細(xì)胞的比例及其動態(tài)變化，結(jié)果如圖2A、B所示：感染后第3天小鼠γδT細(xì)胞的比例(1.10%)較正常對照組小鼠γδT細(xì)胞比例(0.49%)顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例：本實驗首先圈定淋巴細(xì)胞后分析αβT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例(圖3A1)，然后分析檢測αβT細(xì)胞中CD4+Th細(xì)胞和CD8+Tc細(xì)胞的比例(圖3A2)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染后第3天小鼠CD4+Th細(xì)胞和CD8+Tc細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例(圖3A1中αβT細(xì)胞比例與圖3A2中CD4+T或CD8+T

細(xì)胞比例)分別為31.09%和12.56%(圖3B、C)，與正常對照組小鼠CD4+Th/CD8+Tc細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例(36.97%、15.19%)無明顯差異(P>0.05)。 感染后第1天和第7天小鼠肺臟CD4+Th/CD8+Tc細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例與感染后第3天小鼠大致相同(圖3B、C)。上述結(jié)果表明，感染早期肺組織中以γδT細(xì)胞浸潤為主，提示γδT細(xì)胞可能參與H1N1重癥感染小鼠肺組織病理損傷過程。

2.3 感染后不同時間點γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞在肺組織中的分布 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中IL-17+T細(xì)胞，即γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞的比例和數(shù)目，結(jié)果如圖4所示：①感染后第1天γδT17細(xì)胞占總γδT細(xì)胞的比例(22.10%)和數(shù)目(6.15×103個/

圖1 H1N1 流感病毒感染后小鼠體重、生存率和肺組織病理學(xué)變化Fig.1 Changes of body weight,survival rate and histopathology in mice lung tissue after H1N1 influenza virus infectionNote：A.Body weight change；B.Survival rate；C.Lung tissue HE staining showed at different DPI(days post infcetion,DPI)(n=6,×40,bar=100 μm).

圖2 流感病毒感染不同時間肺組織中γδT細(xì)胞比例的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in proportion of γδT cells at different DPINote：A.Flow chart;B.Proportional statistics(n=3);**.P<0.01.

圖3 流感病毒感染不同時間肺組織中CD4+Th/CD8+Tc細(xì)胞比例的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of proportion of CD4+Th/CD8+Tc cells at different DPINote：A1.Flow chart showed the proportion of αβT cells in total lymphocytes at different DPI;A2.Flow chart showed the proportion of CD4+Th/CD8+Tc cells in αβT cells;B.The histogram showed the percent of CD4+Th cells in lung lymphocytes(n=3);C.The histogram showed the percent of CD8+Tc cells in lung lymphocytes(n=3).

圖4 流感病毒感染不同時間γδT17/Th17/Tc17細(xì)胞比例和數(shù)目的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of proportion and number of γδT17/Th17/Tc17 cells at different DPINote：A.Flow chart showed the proportion of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI;B.The histogram showed the percent of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI(n=3);C.The histogram showed the number of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI(n=3);*.P<0.05;**.P<0.01.

肺)較正常對照組小鼠γδT17細(xì)胞占總γδT細(xì)胞的比例(8.83%)和數(shù)目(3.0 ×103個/肺臟)顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；②感染后第1天肺臟中γδT17細(xì)胞的數(shù)目(6.15×103)明顯高于CD4+Th17細(xì)胞(1.35×103)和CD8+Tc17細(xì)胞(0.75×103)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；③感染組小鼠Th17/Tc17細(xì)胞占Th/Tc細(xì)胞的比例和數(shù)目較正常對照組均顯著升高(圖4A～C)，是因肺組織中γδT17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A 對Th17/Tc17細(xì)胞具有趨化募集作用所致[13-15]。上述結(jié)果證實，H1N1重癥感染小鼠肺組織中以γδT17細(xì)胞浸潤為主，表明γδT17細(xì)胞參與H1N1重癥感染小鼠肺組織病理損傷過程。

2.4 感染后BALF和血清中IL-17A濃度顯著升高 采用ELISA法分別檢測正常對照組和感染后1、3、7 d小鼠BALF中IL-17A濃度，結(jié)果如圖5A所示：感染后小鼠BALF中IL-17A濃度隨感染進(jìn)程逐漸升高，第3、7天分別升高至4.96、5.49 pg/ml，與未感染對照組小鼠BALF中IL-17A濃度(1.52 pg/ml)相比存在顯著性差異(P<0.05)。上述結(jié)果證實H1N1重癥感染小鼠早期肺組織中IL-17A濃度顯著升高，表明γδT17細(xì)胞可通過分泌IL-17A 參與肺組織病理損傷過程。

同時發(fā)現(xiàn)感染后第3天小鼠血清中IL-17A濃度(14.56 pg/ml)明顯高于正常對照組小鼠血清IL-17A濃度(7.90 pg/ml)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。

2.5 BALF中與γδT17細(xì)胞活化相關(guān)的細(xì)胞因子濃度顯著增高 γδT細(xì)胞的TCR缺少多樣性，所識別的抗原種類有限。目前研究證實：γδT細(xì)胞可通過表面TCR直接識別結(jié)合某些病毒(單純皰疹病毒、HIV病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)感染的靶細(xì)胞而被激活，并通過釋放細(xì)胞毒性介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫作用[16-19]。但迄今為止尚未見到γδT細(xì)胞可被流感病毒感染靶細(xì)胞激活相關(guān)的研究報道。Ma等[20]關(guān)于IL-1β和IL-23協(xié)同作用可使腫瘤微環(huán)境中γδT17細(xì)胞活化的研究報道，提示γδT17細(xì)胞可能還存在一種γδTCR非依賴的活化途徑。據(jù)此，采用Luminex多因子檢測試劑盒對BALF中相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示：感染后第1、2、3天BALF中IL-1β濃度(420.33、210.21、170.64 pg/ml)和IL-23濃度(58.62、70.36、47.67 pg/ml)較對照組IL-1β濃度(87.76 pg/ml)、IL-23濃度(32.82 pg/ml)顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明，在感染后肺組織局部微環(huán)境中IL-1β和IL-23的協(xié)同作用下，γδT17細(xì)胞也有可能以一種γδTCR非依賴作用方式活化，并通過釋放IL-17A參與肺組織病理損傷過程。

圖6 流感病毒感染后不同時間BALF中IL-1β 和IL-23濃度的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of concentrations of IL-1β and IL-23 in BALF at different DPINote：A.IL-1β;B.IL-23;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

3 討論

NK細(xì)胞在H1N1重癥感染小鼠肺組織炎癥性病理損傷過程中發(fā)揮重要作用[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)H1N1重癥感染組小鼠肺組織中γδT17細(xì)胞占總γδT細(xì)胞的比例和數(shù)目較對照組顯著升高，且明顯高于Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞。結(jié)果表明：在H1N1重癥感染組小鼠早期γδT17細(xì)胞是浸潤肺臟的主要細(xì)胞，而非Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞。感染后第3天BALF和血清中IL-17A濃度較對照組均顯著升高。但BALF中IL-17A的濃度(圖5A)明顯低于血清中IL-17A的濃度(圖5B)，可能是因灌洗液將肺泡分泌液中IL-17A濃度稀釋所致。上述結(jié)果表明，流感病毒感染后被趨化募集至肺臟中的γδT17細(xì)胞可通過釋放IL-17A參與早期肺組織炎癥性病理損傷過程。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在感染后肺組織局部微環(huán)境中IL-1β、IL-23協(xié)同作用下，γδT17細(xì)胞也可能通過與腫瘤微環(huán)境和實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型微環(huán)境中γδT17細(xì)胞相同或相似的活化方式[20，23]，即γδTCR非依賴的作用方式活化，并通過釋放IL-17A參與肺組織炎癥性病理損傷過程。但上述γδTCR非依賴性活化途徑尚需通過體內(nèi)外實驗進(jìn)一步加以驗證。實驗結(jié)果2.3中，感染組小鼠Th17/Tc17細(xì)胞所占CD4+Th/CD8+Tc細(xì)胞的比例和數(shù)目較對照組顯著升高(圖4)，但與肺組織中IL-17A濃度升高無關(guān)的原因如下：Th17/Tc17細(xì)胞作為參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的多克隆T細(xì)胞，其中只有H1N1流感病毒特異性Th17/Tc17細(xì)胞能被相應(yīng)流感病毒激活，并經(jīng)克隆擴增后增殖分化為產(chǎn)生IL-17A的克隆細(xì)胞，但作為初次免疫應(yīng)答這一過程通常需一周以上；而其他Th17/Tc17細(xì)胞不可能被H1N1流感病毒激活，也未見上述適應(yīng)性免疫細(xì)胞(Th17/Tc17細(xì)胞)可被細(xì)胞因子非特異性激活產(chǎn)生IL-17A的研究報道。

在上述研究工作基礎(chǔ)上，課題組(1)根據(jù)γδT細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體8(C-C motif chemokine receptor 8,CCR8)[24]和微環(huán)境中TGF-β可誘導(dǎo)γδT細(xì)胞分化為γδT17細(xì)胞的研究報道[20]，擬對感染后肺組織中相關(guān)的趨化因子(CCL、CCL6)和TGF-β含量的動態(tài)變化及其來源進(jìn)行深入探討；(2)鑒于小鼠γδT細(xì)胞是一個異質(zhì)性群體(包括Vγ1-Vγ7 7個亞群)，擬對肺臟中γδT17細(xì)胞的亞群歸屬、細(xì)胞毒性介質(zhì)和其他炎性細(xì)胞因子的分泌，以及NKG2D和FasL的表達(dá)情況進(jìn)行深入研究；(3)在確定γδT17細(xì)胞的亞群歸屬后，采用相應(yīng)抗體進(jìn)行干預(yù)將其清除，觀測H1N1重癥感染小鼠死亡率和肺組織炎癥損傷能否改善。

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[收稿2016-08-22]

(編輯 許四平)

Distribution of γδT17/Th17/Tc17 cells in lung of H1N1 infected mice and their relationship with immunologic injury of lung

XUEChun-Xue,WENMing-Jie,LIUMeng,ZHANGXu-Long,CAOBin.

BeijingChaoyangHospital,AffiliatedMedicalUniversity,Beijing100020,China

Objective:To investigate the distribution of γδT17,Th17 and Tc17 cells in the lung of mice severely infected by influenza A(H1N1)pdm09 virus and the relationship between these cells with lung immunopathalogical injury.Methods：Intranasal infection was used to establish mouse model of severe H1N1 infection.Flow cytometry assay was used to detect the proportion and number of γδT17 cells,Th17 cells and Tc17 cells in the lung.The concentrations of interleukin-17A(IL-17A),interleukin-1β(IL-1β)and interleukin-23(IL-23) in the bronchoalveolar lavage fluid and serum were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay and Lu-minex assay.Results：①The model of mice severely infected by influenza A(H1N1)pdm09 virus was established successfully.②The ratio of γδT cells,but not CD4+T and CD8+T cells in total lymphocytes of the lung of infected mice significantly increased compared with uninfected control mice at the third day post infection(DPI)(P<0.01).③The proportion and number of γδT17 cells,Th17 cells and Tc17 cells in total γδT cells,Th cells and Tc cells in the lung of infected mice were significant higher than that in uninfected control mice at the first DPI,respectively.However,the absolute number of γδT17 cells was far more than Th17 and Tc17 cells(P<0.05)；④The concentration of IL-17A in BALF increased significantly after infection(P<0.05),and the concentration of IL-17A in serum increased significantly at the third DPI(P<0.05).The concentrations of both IL-1β and IL-23 in BALF probably participating in the activation of γδT17 cells increased significantly after infection compared with uninfected control mice.Conclusion：The γδT17 cells could be activated and secreted IL-17A via γδTCR non-depended pathway and involved in inflammatory pathological injury of lung at the early stage of severe H1N1 infection.

γδT cell;H1N1;Severe influenza;IL-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.018

①本文為國家杰出青年科學(xué)基金(81425001/H0104)、國家自然科學(xué)基金(81271840、81373114)和北京市自然科學(xué)基金(7132072)資助項目。

薛春雪(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)H1N1感染免疫學(xué)研究，E-mail：1099185774@qq.com。

及指導(dǎo)教師：張須龍(1979年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺臟的免疫學(xué)研究，E-mail：zhxlwl@ccmu.edu.cn。 曹 彬(1972年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事呼吸系統(tǒng)感染，呼吸道傳染病等研究，E-mail：caobin_ben@163.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)04-0563-06

②首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，微生態(tài)研究中心，北京 100069。

③首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京100010。

④中日友好醫(yī)院呼吸中心，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京100029。