基于PI3K/AKT/mTOR通路、HIF-1α、ES觀察新風膠囊對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響①

張曉軍 劉 健 萬 磊 黃傳兵

(安徽中醫(yī)藥大學,合肥230038)

·中醫(yī)中藥與免疫·

基于PI3K/AKT/mTOR通路、HIF-1α、ES觀察新風膠囊對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響①

張曉軍 劉 健②萬 磊②黃傳兵②

(安徽中醫(yī)藥大學,合肥230038)

目的：觀察新風膠囊(XFC)對佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠滑膜PI3K/AKT/mTOR通路的影響。方法：將大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、甲氨蝶呤組、雷公藤多苷組、XFC組。采用免疫組化法檢測滑膜微血管密度(MVD)表達，酶聯(lián)免疫吸附法檢測白介素(IL)-6、IL-10、HIF-1α、VEGF-A表達，免疫印跡法檢測PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR、ES蛋白在滑膜血管中表達。結(jié)果：模型對照組滑膜組織MVD計數(shù)升高，血清IL-6、VEGF、HIF-1α和滑膜PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR、ES表達顯著升高，血清IL-10表達量降低；治療后，XFC組MVD呈高計數(shù)量，HIF-1α、 IL-6、VEGF-A表達降低，滑膜PI3K、p-AKT1、mTOR、ES蛋白表達降低，血清IL-10升高。結(jié)論：XFC通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路、HIF-1α、ES表達改善AA滑膜血管新生。

佐劑關(guān)節(jié)炎；血管新生；PI3K/AKT/mTOR通路；新風膠囊

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheurnatoid arthritis，RA)基本病理變化是滑膜炎[1]。RA長期慢性炎癥和病理變化逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔出現(xiàn)低氧環(huán)境，導(dǎo)致滑膜血管新生形成，從而加重滑膜炎癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路在RA滑膜血管新生中起重要作用[2]。PI3K/AKT通路可以激活哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)表達，而 mTOR可進一步增加缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)升高，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-Α)、微血管密度(MVD)及ES表達增強，VEGT-A，ES可以對內(nèi)皮細胞的直接作用，并增加在滑膜新生血管形成[3-5]。某些細胞因子如白細胞介素1(IL-)-6可上調(diào)VEGF的表達；而IL-10等則能抑制VEGF的表達。既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥新風膠囊能明顯降低RA患者關(guān)節(jié)腫痛等癥狀，還能改善滑膜血管新生的表達[6-8]。為進一步觀察新風膠囊的作用機制，筆者通過弗氏完全佐劑(FCA)復(fù)制AA大鼠模型，通過新風膠囊對AA大鼠滑膜新生血管的療效觀察，并研究對滑膜血管PI3K/AKT/mTOR通路、IL-6、IL-10、HIF-1α、VEGF-Α、ES的影響，分析PI3K/AKT/mTOR信號通路、HIF-1α、VEGF-Α、ES、IL-6、IL-10與滑膜血管新生的關(guān)系，探討新風膠囊改善滑膜血管新生的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SD大鼠，由安徽省實驗動物中心提供。實驗動物經(jīng)安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和基礎(chǔ)研究倫理委員會批準審核通過，清潔級標準飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑與藥品 FCA：Sigma，USA,批號：116K8706； VEGF-A試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-1045； MVD試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-376975；IL-6、IL-10試劑盒： RD公司，USA,批號：2013012205、2012100204；HIF-1α試劑盒:Bioworld公司，USA,批號：22061046-1；羊抗PI3K、鼠抗AKT1、兔抗p-AKT1、兔抗mTOR抗體：圣塔克魯茲公司，USA，批號： sc-48637、sc-5298、sc-135650、sc-8319；兔抗內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES):Abcam公司，USA,批號：ab01387；新風膠囊：安徽省中醫(yī)院制劑中心提供,批號2015021504；甲氨蝶呤：上海信誼生產(chǎn)，批號2015110527；雷公藤多苷片：10 mg/片，上海紅旗制藥廠生產(chǎn)，批號2014100114。

1.1.3 儀器與設(shè)備 病理切片機：LEICA，德國,型號：2235；顯微攝像系統(tǒng)：OLYMPUS,日本，型號:BX51T-32000-2；高速冷凍離心機：Sigma，德國，型號：2-16PK。

1.2 方法

1.2.1 模型制備、分組與給藥 將大鼠均分為正常對照組、模型對照組、新風膠囊組、甲氨蝶呤組、雷公藤多苷片組。大鼠右足跖皮內(nèi)注射 0.1 ml FCA制成 AA模型(除正常對照組外)[9]。注射第12天開始給藥，按照實驗動物與人體體表面積比等效劑量換算比例(相當于臨床成人等效劑量8倍)。新風膠囊組0.24 g/100 g，雷公藤多苷片組1 mg/100 g，每天1次；甲氨蝶呤組0.3 mg/100 g，每周1次；正常對照組、模型對照組予生理鹽水灌胃，0.1 g/100 g，每天1次。各組連續(xù)用藥30 d。

1.2.2 血清細胞因子HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10測定 采用ELISA測定血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10的表達。具體步驟依照試劑盒操作。

1.2.3 滑膜MVD測定 將各組大鼠無菌取雙膝關(guān)節(jié)滑膜，常規(guī)制備石蠟包埋切片，行SABC法染色。采用山羊抗鼠MVD多克隆抗體標記血管內(nèi)皮細胞(一抗?jié)舛认♂尡壤?∶200)，結(jié)果在顯微鏡下觀察各組血管新生情況[10]。

1.2.4 滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES檢測 制備組織蛋白樣品，蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES一抗(1∶ 800稀釋)孵育 2 h，分別采用抗羊、小鼠、兔二抗(1∶ 5 000)孵育1 h。用增強化學發(fā)光法顯色，條帶用掃描儀對結(jié)果攝像；以條帶與各組內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10變化 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清IL-10降低，HIF-1α、VEGF-A、IL-6升高 (P<0.01或P<0.05)；與模型對照組比較，新風膠囊組IL-10升高，HIF-1α、VEGF-A、IL-6降低 (P<0.01或P<0.05)；新風膠囊組VEGF-A表達低于雷公藤多苷片組 (P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠滑膜血管MVD計數(shù)比較 模型對照組大鼠血管MVD計數(shù)明顯高表達(P<0.01)。治療后，與模型對照組相比，各治療組MVD計數(shù)量明顯減少；各治療組間比較， 新風膠囊組MVD計數(shù)量低于甲氨蝶呤組(P<0.05)。見圖1。

GroupsHIF?1αVEGF?AIL?6IL?10Normalcontrol32 45±5 38 51 26±9 9744 48±7 1493 47±16 86Modelcontrol82 28±10 982) 93 43±16 492)81 69±10 652) 80 36±12 231)Methotrexate 65 73±11 671)4)5) 66 34±12 341)4)57 17±8 471)4)82 62±12 171)3)5)Tripterygiumglycosides53 65±9 551)4) 74 51±19 941)3)5)53 03±7 311)4)90 75±11 673)XinfengCapsule52 17±7 751)4) 63 60±12 371)4)54 85±6 281)3)95 49±10 433)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with the model control group,3)P<0.05,4)P<0.01;compared with the Xinfeng Capsule group,5)P<0.05.

圖1 滑膜血管MVD計數(shù)比較Fig.1 Comparison of MVD in synovial blood vesselsNote：A.Normal control group；B.Model control group；C.Methotrexate group;D.Tripterygium glycosides group;E.Xinfeng Capsule group;F.Expression of MVD in each group.Compared with the normal control group,▲.P<0.05,▲▲.P<0.01;compared with the model group,*.P<0.05,**.P<0.01;compared with the Xinfeng Capsule group，△.P<0.05.

圖2 滑膜血管PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白表達Fig.2 Expression of PI3K,AKT p-AKT,mTOR,ES protein in synovial vascularNote：1.Normal control group；2.Model control group；3.Methotrexate；4.Tripterygium glycosides group；5.Xinfeng Capsule group;A-E is PI3K,AKT,p-AKT,mTOR,ES.

2.3 大鼠滑膜組織PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白表達 與正常對照組比較，mTOR、PI3K、p-AKT、ES在模型對照組明顯增加(P<0.01或P<0.05)。藥物干預(yù)后，mTOR、PI3K、p-AKT、ES表達在新風膠囊組降低(P<0.01或P<0.05)；與新風膠囊組比較，甲氨蝶呤組PI3K表達升高；雷公藤多苷片組p-AKT表達升高(P<0.05)。見圖2。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活和HIF-1和VEGF蛋白α、ES表達失衡在滑膜血管生成中發(fā)揮重要作用[11-13]。PI3K/Akt通路通過調(diào)節(jié)HIF-1表達并誘導(dǎo)VEGF、ES產(chǎn)生。PI3K/AKT通路激活可導(dǎo)致低氧環(huán)境誘導(dǎo)的滑膜血管的分化、生長，介導(dǎo)細胞生長、發(fā)育和血管調(diào)節(jié)作用。PI3K/AKT通路激活mTOR表達調(diào)節(jié)細胞增殖,誘發(fā)血管形成和血管通透性增加[14,15]。

mTOR上調(diào)可引起mTOR通路的激活，從而進一步導(dǎo)致HIF-1α、VEGF-Α、ES表達升高，加重滑膜炎癥和滑膜血管新生的形成。因此，PI3K/AKT通路過度激活也會促使HIF-1α、ES表達增加。PI3K/AKT/mTOR通路激活后首先直接使HIF-1α升高[16,17]。VEGF-Α、ES上調(diào)后會誘導(dǎo)RA滑膜血管新生。當組織損傷發(fā)生炎癥時，VEGF會被異常表達，而且這種表達會被其他因素所影響。VEGF促血管新生受細胞因子IL-6、IL-10調(diào)節(jié)，細胞因子IL-6、IL-10對VEGF產(chǎn)生直接或間接的影響，在RA的發(fā)病過程中共同促進滑膜血管翳的形成。細胞因子IL-6在RA中呈高表達狀態(tài)，IL-10呈低表達。IL-6上調(diào)和IL-10下調(diào)，可作用于VEGF-A、ES，導(dǎo)致RA血管新生形成。既往研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠滑膜PI3K、AKT、mTOR升高，且PI3K、p-AKT、mTOR分別與HIF-1α、VEGF-A、ES呈正相關(guān)[18]。說明PI3K/AKT/mTOR通路的過度激活和HIF-1α表達上調(diào)可能是促進滑膜血管新生形成原因之一。此結(jié)果與Agani等[19]研究結(jié)論相似。因此，PI3K/AKT/mTOR通路異常激活后可以提高HIF-1α蛋白合成，進而導(dǎo)致VEGF-A、ES升高，從而通過促進滑膜新生血管生長，參與滑膜炎癥的過程和血管病變[20，21]。

根據(jù)以上研究結(jié)果，針對RA滑膜血管新生的特點，可以采用抑制滑膜PI3K/AKT/mTOR通路過度激活，降低滑膜血管炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新風膠囊可降低AA大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，滑膜PI3K、p-AKT、mTOR、ES表達降低，血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6水平下降，而IL-10表達升高。說明新風膠囊可能是通過降低PI3K/AKT 通路蛋白表達，從而阻止mTOR異常激活，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，改善滑膜血管新生。新風膠囊由黃芪、薏仁、雷公藤、蜈蚣等藥物組成。黃芪具有益氣、消腫、健脾、除痹之功，薏苡仁具有化濕、除痹之效。黃芪有效成分黃芪皂甙、黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，黃芪皂甙能降低關(guān)節(jié)腫脹、減少關(guān)節(jié)液和血清炎性細胞因子，黃芪多糖可抑制血管生成作用[22,23]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以抑制PI3K/AKT 通路的激活，減低mTOR蛋白表達，降低HIF-1α mRNA表達水平，從而降低VEGF表達[24,25]。薏苡仁含薏苡素，薏苡素具有抗炎、抑制炎性分子分泌作用，薏苡仁有效成分能降低HIF-1α、VEGF的表達[26]。蜈蚣具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，蜈蚣多糖蛋白復(fù)合物具有可降低VEGF的表達，蜈蚣多糖具有抗血管生成活性。雷公藤含有雷公藤堿等，雷公藤有降低毛細血管通透性、抑制炎性細胞因子IL-6滲出、抗栓塞以及降低HIF-1α、VEGF表達的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能明顯抑制PI3K/AKT 通路激活，還能明顯下調(diào)HIF-1α基因和蛋白表達，抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[27-30]。

總之，新風膠囊改善滑膜血管新生機制可能是通過下調(diào)PI3K、p-AKT、mTOR表達，抑制PI3K/AKT/mTOR通路過度激活，從而降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，減少VEGF釋放，從而進一步減少MVD表達，降低滑膜血管新生。

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[收稿2016-08-07 修回2016-10-25]

(編輯 張曉舟)

Effects of Xinfeng Capsule on synovial angiogenesis based PI3K/AKT/mTOR pathway,HIF-1α,ES in rats model of adjuvant arthritis

ZHANGXiao-Jun,LIUJian,WANLei,HUANGChuan-Bing.

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230038,China

Objective:To observe the effect of Xinfeng Capsule (XFC) on synovial membrane PI3K/AKT/mTOR pathway in adjuvant arthritis (AA) rats.Methods：Rats were randomly divided into normal control group,model control group,methotrexate group,tripterygium glycoside group and XFC group.The expressions of IL-6,IL-10,HIF-1α and VEGF-A were detected by immunohistochemical method,and the expressions of PI3K,AKT1 and p-AKT1 were detected by immunoblotting.Results：Expression of AKT1,mTOR and ES proteins in synovial blood vessels.The expression of IL-6,VEGF,HIF-1α and synovial membrane PI3K,AKT1,p-AKT1,mTOR,ES in the model group were significantly higher than those in the control group The expression of PI3K,p-AKT1,mTOR,ES in synovial membrane decreased,and IL-10 in serum increased in XFC group,and the expression of HIF-1α,IL-6 and VEGF-A were decreased.Conclusion：XFC can improve angiogenesis in AA synovium by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling pathway,HIF-1α and ES expression.

Adjuvant arthritis;Angiogenesis;PI3K/AKT/mTOR pathway;Xinfeng Capsule

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.011

①本文為安徽省科技廳項目(1604f0804030)、國家自然科學基金青年項目(81403388)、安徽省自然基金項目(1508085QH159)、安徽省重點實驗室:現(xiàn)代中醫(yī)內(nèi)科應(yīng)用基礎(chǔ)與開發(fā)研究(1606c08238)和安徽中醫(yī)藥大學校級基金(2014qn025)資助項目。

張曉軍(1976年-)，男，博士，副教授，主要從事中醫(yī)藥防治風濕、類風濕疾病研究，E-mail：zhecho223@sohu.com。

及指導(dǎo)教師：劉 健(1964年-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事中醫(yī)藥防治風濕病研究,E-mail:liujianahzy@126.com。

R593.2

A

1000-484X(2017)04-0533-05

②安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,合肥230038。