不同孔徑微孔濾膜對腫瘤細(xì)胞濾過的影響*

劉文娟,鞏萌,崔寧軒,王穎,趙霄,余春紅,易宗春

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

·調(diào)查研究·

不同孔徑微孔濾膜對腫瘤細(xì)胞濾過的影響*

劉文娟,鞏萌,崔寧軒,王穎,趙霄,余春紅,易宗春

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

目的 探討不同孔徑微孔濾膜對不同直徑大小的腫瘤細(xì)胞的濾過作用及其對過濾后細(xì)胞活性的影響。方法 選擇不同孔徑(1、3、5、8、10 μm)的聚碳酸酯微孔濾膜分別過濾濃度相同但細(xì)胞直徑不同的Jurkat、K562和A549細(xì)胞，測定細(xì)胞通過濾膜的濾過率；光學(xué)顯微鏡測量3種細(xì)胞(包括甲醛固定后的K562)的直徑及其經(jīng)不同孔徑的濾膜過濾后的細(xì)胞直徑；臺盼藍(lán)染色法檢測經(jīng)濾膜過濾后的K562細(xì)胞活性，對細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)，并用生長曲線分析其細(xì)胞增殖能力。結(jié)果 Jurkat、K562和A549細(xì)胞均不能通過1 μm孔徑的濾膜，通過3、5、8、10 μm孔徑濾膜的濾過率均依次升高。經(jīng)3 μm孔徑濾膜濾過的K562細(xì)胞存活率為92.0%，且濾過后的細(xì)胞再培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖能力仍較強(qiáng)。經(jīng)甲醛固定的K562細(xì)胞的濾過率明顯降低，且細(xì)胞平均直徑無明顯變化。結(jié)論 活細(xì)胞能穿過孔徑小于其直徑的濾膜；穿過濾膜的細(xì)胞仍保持活性增殖，但甲醛固定可明顯減少細(xì)胞通過濾膜。

聚碳酸酯微孔濾膜;濾膜孔徑；細(xì)胞直徑;濾過率

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)組織部位脫落，穿過血管壁進(jìn)入血液循環(huán)形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)[1]，但實體腫瘤患者外周血中CTCs含量極少，而從血細(xì)胞中富集和分離CTCs是檢測外周血CTCs的前提。目前，CTC富集和檢測新方法不斷涌現(xiàn)，已經(jīng)文獻(xiàn)證實的可達(dá)數(shù)十種[2]，但由于CTCs含量非常少以及缺乏有效的特異性標(biāo)志物，現(xiàn)有的富集方法主要基于CTCs物理性質(zhì)或免疫磁性。然而，梯度密度離心法敏感性低，免疫磁性分離法會造成假陰性結(jié)果，微流控芯片技術(shù)成本高，均不利于臨床檢測。使用膜過濾法富集 CTCs操作簡便，成本低，且敏感性較高。多數(shù)上皮來源的CTCs直徑為14～26 μm不等，但有些類型腫瘤細(xì)胞較小，如小細(xì)胞肺癌細(xì)胞直徑只有7～10 μm[3]。血細(xì)胞相對于腫瘤細(xì)胞有較大的變形能力，從而能穿過孔徑小于其細(xì)胞直徑的微孔濾膜，如多數(shù)紅細(xì)胞可以穿過孔徑較小的濾膜[4]。但腫瘤細(xì)胞是否具有變形能力，從而穿過孔徑小于其直徑的微孔濾膜目前國內(nèi)外報道少見。本研究旨在分析不同直徑腫瘤細(xì)胞通過微孔濾膜的濾過作用，以及過濾后細(xì)胞的直徑和活性變化。報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑及儀器 K562、A549和Jurkat細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)；可換膜式過濾器、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(北京凱樂思公司)；不同孔徑(1、3、5、8和10 μm)規(guī)格聚碳酸酯微孔濾膜(北京升河濾膜公司)；10 mL注射器(上海治宇公司)；IX73熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；DT5-1離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；胎牛血清(FBS，天津灝洋公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)；4%臺盼藍(lán)溶液(北京鼎國昌盛公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562、A549和Jurkat細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至(7.2～7.4)×105/mL，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 甲醛固定及臺盼藍(lán)染色 收集處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，89×g離心5 min，棄上清，PBS洗滌，89×g離心5 min，重復(fù)3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，89×g離心5 min，重復(fù)3次，用0.4%臺盼藍(lán)溶液染色5 min，PBS洗滌，并用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至(7.2～7.4)×105/mL，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞直徑與濾過率的測定 將K562、A549和Jurkat活細(xì)胞及甲醛固定后的K562細(xì)胞的細(xì)胞濃度調(diào)至(7.2～7.4)×105/mL。分別取200 μL細(xì)胞懸液，用1、3、5、8和10 μm孔徑濾膜濾器過濾，并用800 μL RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗過濾裝置，濾過的液體收集于EP管，用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞直徑及其濾后的細(xì)胞直徑用光學(xué)顯微鏡拍照，利用Image J圖像處理軟件根據(jù)標(biāo)尺的大小測量；細(xì)胞經(jīng)濾膜濾過的濾過率計算公式：濾過率(%)=100%×濾過的液體中細(xì)胞數(shù)/濾過前的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 過濾后K562細(xì)胞活性與再培養(yǎng) 收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至(7.2～7.4)×105/mL。(1)檢測過濾后細(xì)胞的活性：取200 μL細(xì)胞懸液,經(jīng)不同孔徑(1、3、5、8和10 μm)濾膜濾器過濾，并用800 μL培養(yǎng)基沖洗過濾裝置，收集濾過的液體，加入0.4%臺盼藍(lán)染色液染色3 min，計算細(xì)胞存活率，以不經(jīng)膜過濾的K562細(xì)胞進(jìn)行同樣的處理作為對照組。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率計算公式：存活率(%)=100%×活細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。(2)細(xì)胞再培養(yǎng)：分別取上述過濾后的液體接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h,用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照(1、3 μm孔徑的濾膜濾過后的細(xì)胞數(shù)量極少，培養(yǎng)3 d后再拍照)；(3)繪制生長曲線：細(xì)胞經(jīng)1、3、5、8和10 μm孔徑的濾膜多次過濾，將過濾后的細(xì)胞濃度調(diào)至2×105/mL并分別接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每孔細(xì)胞濃度為5×105/mL，以不過濾的K562細(xì)胞作為對照組調(diào)至相同濃度，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)8 d，每天用細(xì)胞計數(shù)板記錄每孔的細(xì)胞濃度。每種孔徑設(shè)3個復(fù)孔，繪制經(jīng)各孔徑過濾后的細(xì)胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用Excel 2010軟件進(jìn)行。多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。微孔濾膜的實孔徑大小與細(xì)胞濾過率的關(guān)系、細(xì)胞直徑大小與細(xì)胞濾過率的關(guān)系通過繪制散點圖，用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞直徑與濾過率 Jurkat、K562、A549的細(xì)胞直徑分別為(11.57±1.25) μm、(13.76±1.71) μm和(17.79±3.90) μm。與濾前細(xì)胞直徑比較，獲得K562濾過后細(xì)胞直徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而固定的K562細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。用不同規(guī)格濾膜過濾K562、Jurkat和A549細(xì)胞時，3者均不能穿過1 μm孔徑；且通過3、5、8、10 μm孔徑濾膜的濾過率均依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。同時，甲醛固定染色后的K562細(xì)胞與活的K562細(xì)胞相比，直徑減小，濾過率明顯降低(P<0.01)，不能穿過孔徑為1 μm和3 μm的濾膜，且5 μm濾膜對其的濾過作用明顯降低。見表2。

表1 K562細(xì)胞經(jīng)不同濾膜過濾后的細(xì)胞直徑(μm)

注：與過濾前比較，*，P<0.05；與活細(xì)胞比較，#，P<0.05；-，無數(shù)據(jù)。

表2 不同孔徑濾膜對各細(xì)胞的濾過率(%)

注： 與10 μm的濾過率比較， *，P<0.01；與固定的K562細(xì)胞比較，#，P<0.01 。

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 濾膜孔徑與濾過率的相關(guān)性 將濾膜孔徑(X)與濾過率(Y)進(jìn)行相關(guān)性分析(1 μm規(guī)格濾膜不參與分析)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濾膜孔徑對Jurkat、活K562、A549、固定K562細(xì)胞的濾過率均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.963，0.943，0.971，0.912，P均<0.01。見圖1。

圖1 微孔濾膜的孔徑與細(xì)胞濾過率的關(guān)系

2.2.2 細(xì)胞直徑與濾過率的相關(guān)性 3、5、8、10 μm孔徑濾膜的濾過率分別與K562細(xì)胞直徑呈明顯負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)分別為-0.915，-0.919，-0.926和-0.885，P均<0.01。見圖2。

2.3 過濾后K562細(xì)胞的活性分析

2.3.1 細(xì)胞存活率 經(jīng)3、5、8和10 μm孔徑濾膜濾過的K562細(xì)胞的存活率分別為(92.0 ±2.0)%、(99.2 ±0.5)%、(99.3 ±0.3)%、(99.7±0.2)%，未濾過對照組細(xì)胞的活性率為(99.7±0.4)%。除3 μm (P<0.01)孔徑的濾膜過濾對細(xì)胞有一定損傷外，更大孔徑濾膜過濾對細(xì)胞基本沒有損傷(P>0.05)。

圖2 細(xì)胞直徑與細(xì)胞濾過率的關(guān)系

2.3.2 生長曲線分析 結(jié)果表明，經(jīng)相同濃度接種過濾后的細(xì)胞培養(yǎng)8 d后，過濾后細(xì)胞的生長曲線與對照組間無明顯差異(F=2.61，P>0.05)。見圖3。

圖3 過濾后K562細(xì)胞的生長曲線

3 討論

本實驗在使用不同孔徑的微孔濾膜對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾的分析時發(fā)現(xiàn)，1 μm孔徑不能過濾K562、Jurkat和A549細(xì)胞，3 μm孔徑的微孔濾膜對3種細(xì)胞均呈不同程度的濾過，但濾過率均在2.5%以內(nèi)，5 μm孔徑的微孔濾膜對3種細(xì)胞的濾過率增加了10倍以上，表明直徑大于濾膜孔徑的細(xì)胞仍能穿過濾膜。另有研究證實，直徑為5～9 μm的紅細(xì)胞可以100%穿過3.3 μm孔徑的濾膜[4]；Coumans等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，直徑15 μm的MDA-231細(xì)胞可穿過孔徑為5 μm的濾膜微孔；因此，不是所有小于腫瘤細(xì)胞直徑的孔徑濾膜，都能有效分離和富集；利用濾膜過濾細(xì)胞懸液時，細(xì)胞的濾過是影響富集細(xì)胞存留于濾膜上(回收率)的主要因素。隨著細(xì)胞直徑越大，過濾回收率越大；適度減小濾膜孔徑會提高回收率[6]。Hosokawwa等[7]利用孔徑8～9 μm的微腔陣列過濾混入血液的NCI-H69、NCI-H82、DMS79、A549、NCI-H358、PC-14、HCC827和NCI-H441細(xì)胞的回收率依次為68%、80%、76%、98%、100%、97%、99%和98%[7]。目前普遍采用8 μm孔徑的微孔過濾對直徑較大的腫瘤細(xì)胞有較好的富集效果，但對直徑較小的腫瘤細(xì)胞富集作用有限。

本試驗中的臺盼藍(lán)染色結(jié)果表明，濾過后的細(xì)胞活性相對于對照組并未出現(xiàn)明顯降低(3 μm除外)；將濾過的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，鏡下觀察及生長曲線證明經(jīng)各孔徑(3、5、8和10 μm)過濾后的細(xì)胞仍能正常生長增殖。較高的變形能力是腫瘤細(xì)胞“擠過”濾膜的微孔重要原因。而變形能力與細(xì)胞自身的骨架結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞膜的粘彈性和細(xì)胞內(nèi)液的黏度等因素密切相關(guān)。例如，直徑15 μm的MDA-231可輕松穿過孔徑為5 μm的濾膜微孔，而直徑為6 μm的聚苯乙烯球由于具有很大的剛性就不能穿過[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，固定染色后的K562細(xì)胞直徑減小，但濾過率降低，不能穿過孔徑為1 μm和3 μm的濾膜，5 μm的濾膜對細(xì)胞的濾過作用明顯降低。表明固定染色可能使其變形能力降低，從而降低了過濾率。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞能穿過孔徑小于其直徑的濾膜，穿過濾膜的細(xì)胞仍保持生長增殖活性，但甲醛固定可顯著減少細(xì)胞通過濾膜，利用過濾方法富集腫瘤細(xì)胞需要考慮到這一點以保證足夠高的回收率。

[1]Pantel K, Speicher MR. The biology of circulating tumor cells[J]. Oncogene, 2016, 35(10): 1216-1224.

[2]Gabriel MT, Calleja LR, Chalopin A,etal. Circulating tumor cells: A review of non-EpCAM-based approaches for cell enrichment and isolation[J]. Clin Chem, 2016, 62(4): 571-581.

[3]Ilie M, Hofman V, Long E,etal. Current challenges for detection of circulating tumor cells and cell-free circulating nucleic acids, and their characterization in non-small cell lung carcinoma patients. What is the best blood substrate for personalized medicine?[J]. Ann Transl Med, 2014, 2(11):107.

[4]Henon Y, Sheard G, Fouras A. Erythrocyte deformation in a microfluidic cross-slot channel[J]. Rsc Advances, 2014, 4(68):36079-36088.

[5]Coumans FA, van Dalum G, Beck M,etal. Filtration parameters influencing circulating tumor cell enrichment from whole blood[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61774.

[6]Coumans FA, van Dalum G, Beck M,etal. Filter characteristics influencing circulating tumor cell enrichment from whole blood[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61770.

[7]Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y,etal. Size-based isolation of circulating tumor cells in lung cancer patients using a microcavity array system[J]. PLoS One, 2013, 8(6): e67466.

(本文編輯：許曉蒙)

Effects of microporous membranes with different pore sizes on the filtration of tumor cells

LIUWen-juan,GONGMeng,CUINing-xuan,WANGYing,ZHAOXiao,YUChun-hong,YIZong-chun

(SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering,BeihangUniversity,Beijing100191,China)

Objective To investigate the filtration roles of microporous membranes with different pore sizes in the tumor cells with different diameters, and effects on the filtered cells. Methods Three kinds of tumor cells with different cell diameters and same concentrations, including Jurkat, K562 and A549, were filtered by the polycarbonate microporous membranes with different pore sizes such as 1, 3, 5, 8 and 10 μm, respectively, and their filtration rates were determined. The diameters of three kinds of tumor cells before and after filtration, and the fixed K562 cells with formaldehyde, were measured by an optical microscope. The activity of the filtered K562 cells were detected by the trypan blue staining. After the filtered K562 cells were re-cultured, their proliferation activity was analyzed by the growth curve. Results Jurkat, K562 and A549 cells couldn′t pass the filter membrane with 1 μm of pore size. The filtration rates of three kinds of tumor cells passing the fliter membranes with 3 μm, 5 μm, 8 μm and 10 μm of pore sizes increased in turn. The survival rate of K562 cells filtered by 3 μm of pore size of membrane was 92.0%, and the proliferation acticity of re-cultured K562 cells was still strong. The filtration rate of the fixed K562 cells with formaldehyde was significantly decreased, and the average diameter of the filtered cells had no obvious change. Conclusion The living cells are able to pass the membranes with the pore sizes less than their diameters. The living cells passed the filter membranes may still maintain their growth and proliferation activity. However, the fixation of formaldehyde may significantly reduce the number of cells passed the membrane.

polycarbonate microporous membrane; pore size of membrane; cell diameter; filtration rate

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.20

國家自然科學(xué)基金(81573192，81072325)。

劉文娟，1992年生，女，碩士研究生，從事外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)研究。

易宗春，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士，E-mail:yizc@buaa.edu.cn。

R73

A

2016-11-05)