血清游離脂肪酸和尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測在2型糖尿病腎病中的診斷價(jià)值

劉倩，楊伏猛，趙紹林，鄭萍，朱偉

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222006；3.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222006)

血清游離脂肪酸和尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測在2型糖尿病腎病中的診斷價(jià)值

劉倩1,2，楊伏猛2，趙紹林3，鄭萍3，朱偉1

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222006；3.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222006)

目的 探討血清游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)及尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(podocalyxin, PCX)在2型糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)中的診斷價(jià)值。方法 選取120例2型糖尿病患者，依據(jù)尿清蛋白/尿肌酐比值(urinary albumin-creatinine ratio, UACR)將患者分為正常清蛋白尿組(NA)、微量清蛋白尿組(MA)和大量清蛋白尿(LA)3組；選取同期體檢健康者40例作為對(duì)照組。檢測各組血清FFA和尿PCX水平并進(jìn)行相關(guān)性分析，采用ROC曲線評(píng)估其對(duì)DN的診斷價(jià)值。結(jié)果 NA組、MA組、LA組以及健康人對(duì)照組血清FFA檢測結(jié)果分別為(0.61±0.14)、(0.81±0.13)、(0.95±0.18)和(0.49±0.11) mmol/L，尿PCX檢測結(jié)果分別為(1.86±0.45)、(4.47±1.48)、(6.72±1.40)和(1.38±0.24) ng/mL，糖尿病患者血清FFA和尿PCX均高于健康人對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，并隨著疾病進(jìn)展而升高。Pearson相關(guān)分析顯示，血清FFA與尿PCX呈正相關(guān)(r=0.73,P<0.05)。血清FFA和尿PCX單獨(dú)檢測診斷DN的敏感性分別為 74.1%和80.6%，聯(lián)合檢測的敏感性為89.5%(P<0.05)。結(jié)論 2型糖尿病患者腎損傷時(shí)血清FFA和PCX明顯升高，兩者對(duì)于DN診斷具有重要的臨床價(jià)值。

糖尿病腎?。挥坞x脂肪酸；足細(xì)胞標(biāo)志蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是2型糖尿病慢性微血管病變的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致殘、致死的重要原因[1]，由于其病程呈現(xiàn)不可逆的進(jìn)展，對(duì)患者的生活質(zhì)量和預(yù)后造成嚴(yán)重的影響。目前，關(guān)于DN發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但如果能夠在DN早期作出診斷，并及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，將具有重要的臨床意義。本研究旨在檢測2型糖尿病患者血清游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)和尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(podocalyxin,PCX)表達(dá)水平，分析其對(duì)DN診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年6月至2016年5月于連云港市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診且依據(jù)2016年美國糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)[2]確診為2型糖尿病患者120例，其中，男60例，女60例，年齡56.6±7.5歲，記錄受試者性別、年齡、血壓、身高、體重、病程等資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿病、妊娠糖尿病、繼發(fā)性糖尿病，2型糖尿病并發(fā)酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥；(2)肝腎功能不全、急性腦出血或腦梗死、腫瘤、外傷等；(3)自身免疫性肝病、慢性病毒性肝炎、藥物性肝病和其他遺傳性疾病所致的肝病和大量飲酒；(4)近1個(gè)月內(nèi)使用過降糖、降脂、降壓等各類藥物。依據(jù)糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，按尿清蛋白/尿肌酐比值(UACR)將研究對(duì)象分為3組，即正常清蛋白尿組(NA)40例(UACR<30 mg/g)，微量清蛋白尿組(MA)42例(30 mg/g≤UACR<300 mg/g)和大量清蛋白尿組(LA)38例(UACR≥300 mg/g)。另外選擇同期于本院體檢中心體檢健康者40例作為健康人對(duì)照組，其中，男21例，女19例，年齡53.7±6.8歲。本研究經(jīng)過連云港市第二人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

1.2 儀器和試劑 AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼公司)；AP-960全自動(dòng)酶免分析儀(日本協(xié)和醫(yī)藥公司)；Human Podocalyxin(PCX)ELISA Kit(批號(hào)：34256022，美國MyBioSource公司)；尿微量清蛋白檢測試劑盒(批號(hào)：AUZ7698)、肌酐檢測試劑盒(批號(hào)：AUZ3109)、葡萄糖檢測試劑盒(批號(hào)：AUZ3314)均購自美國貝克曼公司；FFA檢測試劑盒(批號(hào)：160113，北京九強(qiáng)公司)。

1.3 標(biāo)本采集 囑各研究對(duì)象留取新鮮晨尿10 mL，同時(shí)采集空腹靜脈血5 mL(無抗凝劑)，常溫3 000 r/min離心10 min，將尿上清液和血清分裝后，置于-80 ℃保存。

1.4 檢測方法 尿微量清蛋白測定采用免疫透射比濁法，肌酐測定采用苦味酸法，葡糖糖測定采用己糖激酶法，F(xiàn)FA測定采用酶法，尿PCX測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀、酶聯(lián)儀及相應(yīng)的試劑盒檢測及結(jié)果判讀。

1.5 腎小球?yàn)V過率計(jì)算方法(eGFR) 根據(jù)Cockcroft-Gault方程計(jì)算：CG-GFR(mL/min)=[(140-年齡)×體重(kg)×88.41×0.85(女性)]/[血肌酐(μmol/L)×72]。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床常規(guī)指標(biāo)特征 結(jié)果顯示，DN的發(fā)生及進(jìn)展與年齡、舒張壓無關(guān)，而與糖尿病病程體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、Glu、肌酐、尿清蛋白、UACR有關(guān)。見表1。

表1 各組臨床常規(guī)指標(biāo)特征分析

注：-，表示無數(shù)據(jù)；*，與健康人對(duì)照組比較，P<0.05；Δ，與NA組比較，P<0.05；▲，與MA組比較，P<0.05。

2.2 各組血清FFA及尿PCX檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，糖尿病患者血清FFA及尿PCX水平明顯高于健康人對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，并伴隨糖尿病腎病的進(jìn)展而升高。見表2。

表2 各組血清FFA及尿PCX檢測結(jié)果

注：*，與健康對(duì)照組比較，P<0.05；Δ，與NA組比較，P<0.05；▲，與MA組比較，P<0.05。

2.3 Pearson相關(guān)性分析 以血清FFA為因變量，尿PCX為自變量，進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果血清FFA與尿PCX呈正相關(guān)(r=0.73,P<0.05)。

2.4 血清FFA與尿PCX單獨(dú)以及聯(lián)合檢測對(duì)DN診斷價(jià)值 以eGFR<90 mL/min為cut-off值，通過ROC曲線分析得出，血清FFA診斷最佳切點(diǎn)為0.61 mmol/L，敏感性為74.1%，曲線下面積(AUCROC)為0.82；尿PCX診斷最佳切點(diǎn)是1.61 ng/mL，敏感性為80.6%，AUCROC為0.88；血清FFA與尿PCX聯(lián)合檢測的最佳切點(diǎn)是85.2%，敏感性為89.5%，AUCROC為0.93，均高于單一指標(biāo)檢測結(jié)果。見表3、圖1。

表3 血清FFA與尿PCX以及聯(lián)合檢測對(duì)DN診斷價(jià)值

圖1 血清FFA和尿PCX單獨(dú)及聯(lián)合診斷DN的ROC曲線

3 討論

DN是糖尿病常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致的不良后果是腎功能衰竭、心血管疾病和過早死亡。研究顯示，約有20%～40%的DN患者最終進(jìn)展為終末期腎病[4]。因此及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)于患者的預(yù)后至關(guān)重要[4-5]。尿微量清蛋白在預(yù)示DN發(fā)生和進(jìn)展方面是常用的檢測指標(biāo)，但近來的研究表明，當(dāng)糖尿病患者腎小球?yàn)V過率出現(xiàn)下降時(shí)，尿微量清蛋白的排泄并未增加，該指標(biāo)存在滯后性[6]。因此，對(duì)于DN早期診斷標(biāo)志物的研究顯得尤為重要。血清FFA是反映脂類代謝紊亂的一個(gè)敏感指標(biāo)，主要由皮下和內(nèi)臟脂肪脂解生成，是三酰甘油的水解產(chǎn)物，生理情況下人體血清中含量較低，病理狀態(tài)下具有細(xì)胞毒性和組織毒性，能夠及時(shí)、準(zhǔn)確反映機(jī)體脂類代謝水平[7]。正常情況下，胰島素通過對(duì)脂解限速酶的抑制作用而減少FFA的生成，2型糖尿病患者由于胰島素抵抗導(dǎo)致脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的抗脂解作用的敏感性下降，或在脂肪組織體積增多的情況下脂解增加，引起血清FFA顯著升高[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，DN各期的血清FFA水平明顯高于健康人對(duì)照組，且伴隨DN的進(jìn)展而升高，證實(shí)FFA在DN的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Yu等[8]研究結(jié)果表明，DN患者血漿FFA明顯高于對(duì)照組，并隨著DN進(jìn)展而升高，與本研究結(jié)論基本一致。另有學(xué)者推測，血清FFA影響DN的原因?yàn)镕FA水平的升高導(dǎo)致腎臟小血管和微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，促進(jìn)微小血管內(nèi)膜粗糙、增厚及退行性變，加重腎小球硬化；FFA升高加重了DN的胰島素抵抗等[7,9]。

足細(xì)胞參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障，對(duì)大分子滲透性起決定性作用，其標(biāo)志蛋白PCX是帶有高負(fù)電荷的糖蛋白，主要功能是防止足細(xì)胞足突坍塌，當(dāng)腎小球發(fā)生病變時(shí)，可伴有足細(xì)胞脫落而進(jìn)入尿液，因此，可對(duì)尿液中足細(xì)胞或其碎片(以PCX標(biāo)記)進(jìn)行測定[10]。Habara等[11]應(yīng)用PCX單克隆抗體和熒光激活細(xì)胞分類器測定尿液中PCX陽性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中PCX表達(dá)陽性成分越多，腎小球損害則越為嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法測定尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白PCX，結(jié)果顯示DN各期尿PCX水平明顯高于健康人對(duì)照組，并伴隨DN進(jìn)展而升高。目前，DN診斷標(biāo)志物研究是個(gè)熱點(diǎn)，但尚未見血清FFA與PCX是否存在關(guān)聯(lián)性報(bào)道。通過本研究發(fā)現(xiàn)，血清FFA和尿PCX呈明顯正相關(guān)(r=0.73,P<0.05)，證實(shí)兩者之間有著密切的關(guān)系。研究表明，足細(xì)胞中膽固醇聚集導(dǎo)致的脂毒性是DN的關(guān)鍵致病因素，足細(xì)胞的丟失是DN的重要標(biāo)志，而血清FFA的升高、代謝紊亂可導(dǎo)致脂毒性[12]。另有研究顯示，在DN早期，F(xiàn)FA氧化和運(yùn)輸紊亂及其抗氧化反應(yīng)，可破壞足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎小球疾病[13]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了上述結(jié)論，表明FFA和足細(xì)胞損傷有著密切的關(guān)聯(lián)。

本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，在DN診斷價(jià)值方面，尿足細(xì)胞標(biāo)志蛋白PCX敏感性優(yōu)于血清FFA，聯(lián)合檢測則進(jìn)一步提高DN診斷敏感性、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確性，因此，在DN早期診斷方面，該指標(biāo)具有較高的臨床預(yù)測價(jià)值。Hara等[14]研究結(jié)果表明，在正常清蛋白尿的糖尿病患者中，有53.8%的患者尿足細(xì)胞(以PCX標(biāo)記)出現(xiàn)升高，說明其對(duì)于DN早期診斷陽性率要高于尿清蛋白。Hara等[14]研究結(jié)果與本結(jié)論一致，但其對(duì)DN診斷敏感性低于本研究結(jié)果，其可能的原因?yàn)椋?1)是研究對(duì)象存在一定的個(gè)體差異；(2)是方法學(xué)之間存在差異。由于本研究選取樣本量相對(duì)偏少，故今后需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，血清FFA和尿PCX對(duì)于DN的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的診斷價(jià)值，其聯(lián)合檢測在DN的發(fā)生、發(fā)展過程中具有一定的臨床預(yù)測價(jià)值。血清FFA及尿PCX可作為生物學(xué)標(biāo)志物用以預(yù)測2型DN的發(fā)生和進(jìn)展。

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(本文編輯：許曉蒙)

Diagnostic values of serum free fatty acids and urine podocalyxin in the patients with type 2 diabetic nephropathy

LIUQian1,2,YANGFu-meng2,ZHAOShao-lin3,ZHENGPing3,ZHUWei1

(1.MedicalCollegeofJiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofMedicalLaboratory,LianyungangSecondPeople′sHospital,Lianyungang222006,Jiangsu; 3.DepartmentofMedicalLaboratory,LianyungangFirstPeople′sHospital,Lianyungang222006,Jiangsu,China)

Objective To investigate the diagnostic values of serum free fatty acids(FFA) and urine podocalyxin(PCX) in the patients with type 2 diabetic nephropathy(DN). Methods A total of 120 patients with type 2 diabetes mellitus(DM) were enrolled, and they were divided into three groups, normal albumin group(NA), microalbuminuria group(MA) and heavy albuminuria group(HA), based on the urinary albumin-creatinine ratio(UACR). In addition, 40 healthy persons participated in medical examination were selected as the control group. Serum FFA levels were detected by a biochemical analyzer and urine PCX levels by ELISA. The correlation between them was analyzed by Pearson correlation, and their diagnostic values in type 2 DN were evaluated by the receiver operating characteristic curve(ROC). Results Serum FFA levels in the NA, MA, HA and control groups were(0.61±0.14),(0.81±0.13),(0.95±0.18) and(0.49±0.11) mmol/L, respectively, and urine PCX levels were(1.86±0.45),(4.47±1.48),(6.72±1.40) and(1.38±0.24) ng/mL, respectively. The levels of serum FFA and urine PCX in type 2 DM patients were significantly higher than those in the control group(P<0.05), and increased with the progression of type 2 DM. Pearson correlation analysis showed that serum FFA levels were positively correlated with urine PCX levels(r=0.73,P<0.05). The sensitivity of serum FFA, urine PCX and combined detection in the diagnosis of type 2 DN were 74.1%, 80.6% and 89.5%, respectively, and the latter significantly higher than the former two(P<0.05). Conclusion Serum FFA and urine PCX levels increase significantly in diabetic patients with renal injury, and both of them have important clinical values in the diagnosis of type 2 DN.

diabetic nephropathy; free fatty acid; podocalyxin

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.09

劉倩，1985年生，女，主管技師，大學(xué)本科，主要從事臨床血液學(xué)研究工作。

朱偉,研究員，博士研究生導(dǎo)師， E-mail: zhuwei@ujs.edu.cn。

R446

A

2017-01-20)