胃癌患者血清外泌體中DANCR表達及其臨床意義*

李陽，潘磊，梁煒，張鵬，錢暉，許文榮，張志堅，蔣鵬程，張徐

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫，214000；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

·臨床實驗研究·

胃癌患者血清外泌體中DANCR表達及其臨床意義*

李陽1,2，潘磊1,3，梁煒1，張鵬1，錢暉1，許文榮1，張志堅1，蔣鵬程3，張徐1

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫，214000；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

目的 檢測胃癌患者血清外泌體(exosome)中抗分化非編碼RNA(DANCR)的表達水平并分析其臨床應用價值。方法 采用實時熒光定量RT-PCR檢測胃癌細胞培養(yǎng)上清和胃癌患者血清exosome中DANCR表達水平，分析其與臨床病理資料的相關性，繪制ROC曲線評價其診斷效能。結果DANCR在人胃癌細胞系HGC-27中表達水平(4.43±0.37)明顯高于胃黏膜上皮細胞(1.01±0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HGC-27細胞培養(yǎng)上清exosome中DANCR表達水平(3.06±0.14)明顯高于GES-1細胞(1.01±0.20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DANCR在胃癌患者血清exosome中的平均含量[5.060(1.380, 22.785)]較胃良性疾病患者[0.535(0.340, 1.380)]和體檢健康者[1.200(0.605, 1.655)]明顯升高(Z分別為-3.409,-4.229,P均<0.01)，且與腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結轉移相關。胃良性疾病患者與體檢健康者相比，血清exosome中DANCR含量差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.308,P>0.05)。胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.777，95%可信區(qū)間(CI)為0.678～0.876，cut-off值2.50，敏感性為68.6%，特異性為84.4%。結論 胃癌患者血清exosome中DANCR表達水平升高，有望成為胃癌診斷的新指標。

胃癌；外泌體；抗分化非編碼RNA；血清

外泌體(exosome)是細胞分泌的一種膜性囊泡，通過攜帶多種生物活性分子(包括蛋白質(zhì)和核酸)，介導細胞間信號傳遞[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，exosome在腫瘤患者血清中穩(wěn)定存在，exosome及其來源分子在腫瘤診斷、療效監(jiān)測和預后判斷中具有良好應用價值[2-4]。本研究通過檢測胃癌細胞培養(yǎng)上清exosome及胃癌患者血清exosome中抗分化非編碼RNA(anti-differentiation antagonizing noncoding RNA,DANCR)的表達水平，并分析其臨床意義，以評估exosome中DANCR作為胃癌診斷新指標的臨床效能。

1 材料和方法

1.1 研究對象 采集2015年7月至2016年7月江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科就診的51例胃癌患者，男42例，女9例，年齡35～88歲，中位年齡61歲。所有納入的胃癌患者均經(jīng)病理組織學活檢確診，標本采集前均未行放化療、手術治療或全身治療。排除其他腫瘤病史以及術前行化療或放療等輔助治療的患者。根據(jù)TNM分期系統(tǒng)(2010年第7版)進行腫瘤分期。選取同期就診的經(jīng)胃鏡確診為胃炎且不同時患有其他消化系統(tǒng)疾病的12例患者作為胃良性疾病組，男7例，女5例，年齡34～78歲，中位年齡56歲。收集同期年齡和性別匹配的體檢健康者32例作為對照組，男18例，女14例，年齡32～75歲，中位年齡58歲。標本采集經(jīng)江蘇大學醫(yī)學倫理學委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2 血標本采集及處理 采集各研究對象治療前(體檢健康者體檢時)的空腹靜脈血，4 ℃、300×g離心10 min分離血清，4 ℃、12 000×g離心10 min以去除細胞碎片，血清分裝后置-80 ℃保存。

1.3 細胞系、主要試劑和儀器 人胃黏膜上皮細胞系GES-1、人胃癌細胞系HGC-27購自中科院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司)，exosome提取試劑盒(SBI公司)，Trizol提取液(Invitrogen公司)，QIAzol裂解液、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(Qiagen公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix(康為世紀公司)；cobos e601電化學發(fā)光免疫分析儀及配套的CEA 和CA199檢測試劑盒(Roche公司),CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)及上清收集 取生長狀態(tài)良好的GES-1(5×105個)和HGC-27(5×105個)細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞融合度達50%時，PBS洗滌3次，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清，4 ℃、300×g離心10 min去除細胞碎片，0.22 μm濾膜過濾后分裝凍存于-80 ℃。

1.5 細胞上清及血清exosome提取 按照血清exosome提取試劑盒說明書操作提取胃癌患者、胃良性疾病患者、體檢健康者血清(各250 μL)及胃癌細胞、胃黏膜上皮細胞培養(yǎng)上清(各250 μL)中的exosome，樣本置-20 ℃保存。

1.6 RNA提取及逆轉錄反應 用Trizol試劑提取胃癌細胞系HGC-27(1×106個)和胃黏膜上皮細胞系GES-1(1×106個)總RNA，用QIAzol裂解液提取胃癌細胞培養(yǎng)上清、胃癌患者、胃良性疾病患者及體檢健康者血清exosome中總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的RNA樣本，按逆轉錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉錄為cDNA，均置-20 ℃保存。

1.7 實時熒光定量PCR 采用Primer Premier 5.0 軟件設計DANCR(NR_024031.2)和U6(NG_043158.2)的引物，并由上海英濰捷基公司合成。DANCR上游引物序列(F)：5′-GCGCCACTATGTAGCGGGTT-3′；下游引物序列(R)：5′-TCAATGGCTTGTGCCTGTAGTT-3′，產(chǎn)物片段大小為156 bp。U6上游引物序列(F)： 5′-CTCGCTTTGGCAGCACA-3′； 下游引物序列(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物片段大小為94 bp。采用CFX96實時熒光定量PCR儀進行分析。熒光定量PCR反應體系: 2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、上、下游引物(5 mmol/L)各1 μL、cDNA 樣本1 μL、RNase-free ddH2O 12 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。采用CFX96 Manager軟件于72 ℃時采集熒光信號及進行熔解曲線分析。DANCR的相對表達水平以2-ΔΔCt法計算，公式：ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct管家基因)]。

1.8 血清CEA 和CA199檢測 按照cobos e601電化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒說明書操作檢測各研究對象血清CEA和CA199的表達水平。CEA參考范圍為0～10 ng/mL，CA199參考范圍為0～30 U/mL。

2 結果

2.1DANCR在胃癌細胞及其培養(yǎng)上清exosome中的表達 定量RT-PCR檢測結果顯示，DANCR在HGC-27細胞中含量(4.43±0.37)明顯高于GES-1細胞(1.01±0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-13.106，P<0.05)；DANCR在HGC-27細胞培養(yǎng)上清exosome中的表達水平(3.06±0.14)亦明顯高于GES-1細胞(1.01±0.20)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-20.006，P<0.05)。

2.2DANCR在胃癌患者血清exosome中的表達DANCR在胃癌患者血清exosome中的含量[5.060(1.380, 22.785)]較胃良性疾病患者[0.535(0.340, 1.380)]和體檢健康者[1.200(0.605, 1.655)]均明顯升高(Z分別為-3.409，-4.229,P均<0.01)，而胃良性疾病患者與體檢健康者間差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.308,P>0.05)。

2.3DANCR與臨床資料相關性分析DANCR的表達水平與胃癌患者腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結轉移相關，而與性別、年齡、分化程度、浸潤深度及血管或神經(jīng)受累無關。見表1。

表1 胃癌患者血清exosomes內(nèi)DANCR表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

參數(shù)例數(shù)DANCR相對表達量ZPr性別 男425.44(2.19,22.86)-1.8780.060-0.266 女91.52(1.00,20.25)年齡(歲) <60149.04(1.36,19.28)-0.0800.937-0.011 ≥60374.69(1.52,24.03)腫瘤大小(cm) <5221.54(0.96,26.13)-3.3970.0000.480 ≥5295.82(3.12,16.35)分化程度* 中分化228.65(1.53,28.20)-0.0770.5390.088 低分化264.01(1.05,15.30)淋巴結轉移 有3611.22(3.57,32.41)-3.7320.0000.528 無151.24(0.99,3.32)浸潤深度 T1/T246.44(1.21,12.81)-0.9320.3560.132 T3/T4475.06(1.54,25,12)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ期151.24(0.99,4,71)-3.7320.0000.524 Ⅲ/Ⅳ期369.22(3.06,31.12)血管或神經(jīng)受累 有137.31(3.12,20.25)-1.2730.2060.180 無384.48(1.15,22.86)

注：*，3例病例資料缺失。

2.4 胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲線分析及診斷效能 以胃良性疾病患者和體檢健康者作為對照組(44例)，胃癌患者作為疾病組(51例)，繪制ROC曲線分析胃癌患者血清exosome中DANCR的診斷價值。胃癌患者血清exosome中DANCR的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.777，95%可信區(qū)間(CI)為(0.678～0.876)，當cut-off 值為2.50時，敏感性為68.6%，特異性為84.4%。血清exosome中DANCR對胃癌的診斷效能高于CEA(AUCROC=0.537) 和CA199(AUCROC= 0.596)。

3 討論

Exosome的內(nèi)容物主要包括DNA、mRNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等。LncRNA是一類長度大于200個核苷酸的RNA，無蛋白質(zhì)編碼能力，但可通過多種機制參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等重要生物學功能[5-7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤細胞exosome中均富含lncRNA[8-9]，但有關腫瘤患者血清exosome中l(wèi)ncRNA表達及其臨床應用價值的研究仍較少。Liu等[9]報道CRNDE-h可在結腸癌患者血清exosome中被檢測出，其高表達提示患者預后不良；且當cut-off值為0.02時，AUCROC可達0.892，靈敏度70.3%，特異性94.4%，比傳統(tǒng)指標CEA的診斷效能更佳，具有成為結腸癌血清診斷和預后標志物的潛在價值。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以通過釋放exosome的形式在不同細胞間傳遞lncRNA[10]。Qu等[11]報道舒尼替尼耐藥的腎癌細胞可通過exosome傳遞lncARSR至舒尼替尼敏感的腎癌細胞中，發(fā)揮ceRNA作用，還可通過與miR-34和miR-449結合，上調(diào)AXL和c-MET表達，誘導耐藥性產(chǎn)生，表明腫瘤細胞exosome介導的lncRNA轉運是參與腫瘤惡性進展的重要機制。

Yuan等[11]最早通過芯片分析在肝癌中檢測出DANCR，發(fā)現(xiàn)其高表達于肝癌組織中，且與肝癌患者預后不良相關。隨后，Ma等[12]證實DANCR具有促進肝癌生長和轉移的作用，可作為肝癌分子診斷的指標。Jia等[13]發(fā)現(xiàn)DANCR在前列腺癌中的表達水平升高，具有促進腫瘤轉移的作用。Liu等[14]也發(fā)現(xiàn)在結腸癌中DANCR表達上調(diào)。然而，DANCR在胃癌中的表達情況仍不非常清楚。Karlsson等[15]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)人乳汁來源的胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)中存在DANCR，但是到目前為止，國內(nèi)尚未見DANCR在腫瘤EVs(包括exosome)中的相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞exosome及胃癌患者血清exosome中可檢測出DANCR，而且胃癌細胞exosome中DANCR表達水平較胃黏膜上皮細胞明顯增加，胃癌患者血清exosome中DANCR表達水平較胃良性疾病患者和體檢健康者亦明顯增加，且胃癌患者血清exosome中DANCR高表達與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移相關，這與Liu等[14]在結腸癌中的報道相一致。此外，ROC曲線分析結果顯示胃癌血清exosome中DANCR的AUCROC達0.777，優(yōu)于傳統(tǒng)血清學指標CEA和CA199，提示DANCR具有成為胃癌診斷新指標的潛能。但DANCR在腫瘤中的作用機制尚不明確，目前僅有少量報道，如Yuan等[11]報道DANCR在肝癌細胞中通過與β-cateninmRNA結合，抑制miR-214/320a/199a降解β-cateninmRNA，從而上調(diào)β-catenin蛋白表達，促進肝癌細胞干性維持。Jia等[13]報道在前列腺癌細胞中DANCR通過介導EZH2結合到TIMP-2/3基因啟動子區(qū)，下調(diào)其表達水平，從而促進前列腺癌細胞遷移和侵襲。以上研究提示DANCR可能通過與蛋白質(zhì)或RNA結合進行基因表達調(diào)控，從而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的促進作用。

本研究不足之處在于樣本量相對較少以及未分析DANCR表達水平與胃癌患者的預后關系。后續(xù)研究中我們將擴大樣本驗證DANCR在胃癌患者血清exosome中的表達，比較其在胃癌患者術前/術后血清exosome中表達水平的變化，并分析其與胃癌生存率的相關性。此外，我們還將探討exosome來源的DANCR在胃癌中的生物學作用及機制，以進一步明確其在胃癌診斷中的應用價值。

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(本文編輯：許曉蒙)

Detection and clinical value of serum exosomalDANCRin gastric cancer patients

LIYang1,2,PANLei1,3,LIANGWei1,ZHANGPeng1,QIANHui1,XUWen-rong1,ZHANGZhi-jian1,JIANGPeng-cheng3,ZHANGXu1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,WuxiTraditionalChineseMedicineHospital,Wuxi214000,Jiangsu; 3.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212002,Jiangsu,China)

Objective To detect the expression levels of anti-differentiation antagonizing noncoding RNA(DANCR) in exosomes from serum of gastric cancer patients and evaluate its clinical application. Methods The expression levels ofDANCRin exosomes derived from the culture supernatants of gastric cancer cell lines and the serum samples of gastric cancer patients were detected by using real-time qRT-PCR. The correlations betweenDANCRlevels and the clinicopathological parameters were analyzed. A receiver operating characteristic(ROC) curve was drawn to evaluate the diagnostic efficiency ofDANCR. Results The expression level ofDANCRin HGC-27 cell(4.43±0.37) was significantly higher than that in GES-1 cells(1.01±0.01)(P<0.05). The expression levels ofDANCRin exosomes from the supernatants of HGC-27 cells(3.06±0.14) were significantly higher than that from GES-1 cells(1.01±0.20)(P<0.05). The expression levels ofDANCRin exosomes from the serum samples of gastric cancer patients [5.060(1.380, 22.785)] were significantly higher than that in gastric benign disease [0.535(0.340, 1.380)](Z=-3.409,P<0.01) and healthy controls [1.200(0.605, 1.655)](Z=-4.229,P<0.01). There was no significant difference in the expression levels of serum exosomalDANCRbetween gastric benign disease group and healthy control group(Z=-1.308,P>0.05). In addition, the expression levels ofDANCRin gastric cancer patients were related to tumor size, TNA stage and lymph node metastasis. The area under the ROC curve of serum exosomalDANCRexpression levels was 0.777 in the diagnosis of gastric cancer, the 95% confidence interval was 0.678 to 0.876 and the cutoff value was 2.50. The sensitivity was 68.6% and the specificity was 84.4%. Conclusion The expression level of serum exosomalDANCRmay increase in gastric cancer patients and could be served as a novel marker for the diagnosis of gastric cancer．

gastric cancer; exosome; anti-differentiation antagonizing noncoding RNA; serum

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.04

國家自然科學基金面上項目(81572075, 81672416)；江蘇省自然科學基金面上項目(BK20141303)；江蘇省重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(BE2015667)；鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(SH2015034)；江蘇省“青藍工程”。

李陽，1983年生，男，主管技師，碩士研究生，從事臨床分子生物學檢驗研究。

張徐，副教授，博士研究生導師，E-mail：xuzhang@ujs.edu.cn。

R375.2

A

2016-12-20)