液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和循環(huán)酶法測定血清中同型半胱氨酸的相關性

趙瑞，李鵬飛，于偉越，杜萍，趙志霞，劉洪川，劉麗宏

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院藥事部，北京 100020)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和循環(huán)酶法測定血清中同型半胱氨酸的相關性

趙瑞，李鵬飛，于偉越，杜萍，趙志霞，劉洪川，劉麗宏

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院藥事部，北京 100020)

目的 分析液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法與循環(huán)酶法測定人血清中同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)濃度的相關性。方法 收集63例患者的血清樣本，用LC-MS/MS法和循環(huán)酶法分別測定相同樣本的HCY濃度，并評價2種方法的相關性。結(jié)果 LC-MS/MS法與循環(huán)酶法對HCY濃度測定的結(jié)果分別為(19.11±15.69)μmol/L和(16.95±14.41)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.25，P<0.05)。2種方法的線性回歸方程為YLC-MS/MS法=1.074X循環(huán)酶法+0.892，相關系數(shù)(R)=0.987，相關性較好。結(jié)論 LC-MS/MS法與循環(huán)酶法測定血清中HCY濃度的相關性較好，LC-MS/MS法適用于臨床對HCY的檢測。

同型半胱氨酸；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；循環(huán)酶法；相關性

同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是心腦血管疾病的獨立危險因素[1-3]。因此，HCY測定對于心腦血管疾病的預防和早期診斷具有重要意義。近年來臨床常用的HCY檢測方法有生化法[4]、免疫法[5]、循環(huán)酶測定法[6]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[7]等，LC-MS/MS法測定血清HCY濃度具有分析時間短、樣品處理快速簡便、專屬性強、準確性和靈敏度高以及成本低等優(yōu)點。本研究通過比較分析2種方法對同一HCY血清樣本的檢測結(jié)果，評價2種方法的相關性，為臨床采用LC-MS/MS法測定HCY提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 3200MD型質(zhì)譜儀及Analyst 1.6.1工作站(美國AB SCIEX公司)，LC-20ADXR液相分析儀(日本島津公司)；同型半胱氨酸檢測試劑盒(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，上海復星長征公司)。ADVIA?2400全自動生化分析儀(德國西門子公司)，同型半胱氨酸測定試劑盒(循環(huán)酶法，中生北控公司)。

1.2 LC-MS/MS法

1.2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為KinetexTM2.6 μm C18色譜柱，100 mm×3 mm；流動相：含0.02 %甲酸的水溶液和含0.02 %甲酸的甲醇溶液梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速為0.2 mL/min，進樣量為20 μL。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子方式掃描；離子噴射電壓：5 500 V；霧化溫度：400 ℃；霧化氣/輔助氣(GS1/GS2)：50 psi；氣簾氣(Curtain Gas)：20 psi；碰撞氣(Collision CAD)：5 psi；去簇電壓：25 V；碰撞電壓：15 V；掃描模式為多重反應監(jiān)測(MRM)；Q1/Q3離子通道分別選擇為m/z：136.1→90.1(同型半胱氨酸)和140.1→94.1(內(nèi)標)。

1.2.2 樣品處理 準確吸取50 μL待測樣本于1.5 mL離心管中，分別加入50 μL內(nèi)標液(DL-高胱氨酸-D8溶液)和50 μL還原劑(1,4-二硫蘇糖醇溶液)，混勻；室溫放置30 min后，再加入50 μL蛋白質(zhì)沉淀劑(三氯醋酸溶液)，渦旋混合30 s，15 000 r/min離心3 min，吸取上清，按照同型半胱氨酸檢測試劑盒進行檢測。試劑盒檢測線性范圍為5～45 μmol/L,超出范圍樣品稀釋后復測。

表1 液相梯度洗脫程序

1.3 循環(huán)酶法 采用ADVIA?2400全自動生化分析儀和同型半胱氨酸測定試劑盒(循環(huán)酶法)進行樣品處理(同1.2.2所示)和檢測，每個樣本的處理和測定1次。試劑盒檢測線性范圍為3～50 μmol/L,超出范圍樣品稀釋后復測。

1.4 研究對象 收集2016年6月21-22日在我院進行HCY檢測的血清樣本63例，男25例，年齡26～82歲，中位年齡56歲；女性39例，年齡26～81歲，中位年齡57歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準。采集各研究對象清晨空腹靜脈血3～4 mL，置于2～8 ℃保存，2 h內(nèi)分離血清并進行檢測。排除嚴重溶血、污染的樣本。

2 結(jié)果

2.1 HCY濃度檢測結(jié)果 結(jié)果顯示， LC-MS/MS法與循環(huán)酶法檢測HCY濃度的結(jié)果分別為(19.11±15.69)μmol/L和(16.95±14.41)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t= 6.25，P<0.05)。

2.2 相關性檢驗結(jié)果 LC-MS/MS法與循環(huán)酶法測定結(jié)果具有明顯的線性關系，線性回歸方程式為：YLC-MS/MS法=1.074X循環(huán)酶法+0.892，相關系數(shù)(R)=0.987，P<0.05，兩法的相關性良好。

3 討論

血清HCY水平是臨床上早期診斷心腦血管疾病的重要指標[8-9]，對心血管疾病和許多其它疾病的預防、診斷、治療都有重要的臨床意義。目前，測定HCY的方法有很多種，例如生化法、免疫法和高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法等，每種方法都有其優(yōu)缺點。據(jù)統(tǒng)計，循環(huán)酶法是參加室間質(zhì)評實驗室中選用數(shù)量最多的方法[10]。但循環(huán)酶法存在反應過程復雜、特異性不強，并且所需試劑昂貴等缺點，而LC-MS/MS法具有特異性好、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點，并且可以批量處理標本，進行高通量檢測，近年來其在臨床檢測中的應用越來越廣泛，尤其適合開展大規(guī)模臨床HCY研究。

為了保證臨床用2種檢測方法得到的結(jié)果一致性好、可參考價值高，本實驗對2種檢測結(jié)果的相關性進行研究以及結(jié)果分析。在樣本的采集過程中，由于全血樣本采集離體后仍然能持續(xù)合成HCY，因此，為了保證2種方法評價結(jié)果客觀、準確，本研究嚴格要求采集過程，采血后立即置于2～8 ℃保存，并在2 h內(nèi)離心分離血清。循環(huán)酶法測定血清HCY的主要干擾因素為血氨，而有學者發(fā)現(xiàn)，血氨濃度<70 μmol/L時，HCY濃度測定值與原始值的偏差均<5%[10]。另外，當血紅蛋白≤3.75 g/dL、膽紅素≤20 mg/dL、乳糜≤1 000 mg/dL、維生素C≤10 mg/dL時對循環(huán)酶法測定血清HCY無明顯干擾[11]。本實驗為了排除以上干擾，要求血清新鮮，無黃疸，排除嚴重溶血、污染的樣本，否則測定結(jié)果會高于實際濃度。在樣本存放及預處理的步驟保持一致，避免了該過程人為造成的誤差。

本實驗對2種方法測定結(jié)果統(tǒng)計分析顯示，2組數(shù)據(jù)結(jié)果存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，因此，建議在臨床上提供HCY檢驗報告時，同時提供方法學的信息，以便醫(yī)生對不同醫(yī)院采用不同方法的測定結(jié)果進行更準確地比對，為患者提供更精準的治療。此外，對2組結(jié)果進行相關性分析，其線性回歸方程式Y(jié)LC-MS/MS法=1.074X循環(huán)酶法+0.892，R=0.987，表明2種檢測方法在測定濃度范圍內(nèi)相關性良好。然而本研究由于樣本量有限，并且每種檢測方法只使用了一種試劑盒，更精確的結(jié)果間互相推算還需要進一步的研究。

[1]Li J, Li B, Qi JF,etal. Meta-analysis of clinical trials of folic acid, vitamin B12 and B6 supplementation on plasma homocysteine level and risk of cardiovascular disease[J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2015, 43(6): 554-561.

[2]Kamat PK, Vacek JC, Kalani A,etal. Homocysteine induced cerebrovascular dysfunction: a link to alzheimer′s disease etiology[J]. Open Neurol J, 2015,24(9): 9-14.

[3]穆銀玉, 謝服役, 黃純蕾. 寧波49 079例同型半胱氨酸檢測結(jié)果分析[J]. 上海預防醫(yī)學, 2016, 28(8): 568-569.

[4]Kellogg MD, Parker R, Ricupero A,etal. Evaluation of an enzymatic homocysteine assay for the Hitachi series chemistry analyzer[J]. Clin Chim Acta, 2005, 354(1-2): 117-122.

[5]趙靜. 循環(huán)酶法與熒光偏振免疫法測定血清同型半胱氨酸水平的結(jié)果比較[J]. 河北醫(yī)學, 2014, 20(11): 1801-1804.

[6]陳桂媛.妊娠高血壓綜合征患者血清Hcy和CRP水平的初步觀察[J].臨床檢驗雜志，2011,29(9)：697.

[7]Han JC, Li GL, Wang XC,etal. Determination of homocysteine in dried blood spots using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Chromatog, 2016, 34(6):567-571.

[8]Yang F, Tan HM, Wang H,etal. Hyperhomocysteinemia and atherosclerosis[J]. Acta Physiologica Sinica, 2005, 57(2): 103-114.

[9]張嘯飛, 胡大一, 丁榮晶, 等. 中國心腦血管疾病死亡現(xiàn)況及流行趨勢[J]. 中國高血壓雜志, 2012, 40(3): 179-187.

[10]閆慧慧, 羅金剛, 駱飛, 等. 國產(chǎn)循環(huán)酶法檢測同型半胱氨酸試劑盒的分析性能評價[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2016, 13(16): 2272-2275.

[11]陳渡波，何秋瑩，杜倩怡，等.循環(huán)酶法測定血清同型半胱氨酸的方法學評價[J].熱帶醫(yī)學雜志，2016,16(4)：437-439,455.

(本文編輯：許曉蒙)

A correlational study of two methods of concentration determination for serum homocysteine: liquid chromatography-tandem mass spectrometry method and enzymatic cycling assay

ZHAORui,LIPeng-fei,YUWei-yue,DUPing,ZHAOZhi-xia,LIUHong-chuan,LIULi-hong

(DepartmentofPharmacy,BeijingChao-yangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Objective To analyze the correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for determination of homocysteine concentration in human serum, and the application of two methods in the determination of homocysteine concentration. Methods Homocysteine concentrations of 63 serum samples were collected and determined by LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay, respectively. The correlation between the concentrations by different methods was analyzed and evaluated. Results The concentrations were(19.11±15.69) μmol/L by LC-MS/MS method and(16.95±14.41) μmol/L by enzymatic cycling assay, the P value evaluated by paired-samples T test showed that there was statistical difference among the concentrations determined by two different methods(t=6.25,P<0.05). The conversion formula wasYLC-MS/MS method=1.074Xenzymatic cycling assay+0.892，R=0.987. Conclusion There is good correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for the determination of homocysteine concentration in serum, providing a theoretical basis for estimating the concentrations in the same serum sample by the two methods.

homocysteine; LC-MS/MS method; enzymatic cycling assay; correlation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.03

北京市金橋工程種子資金(2014-46-C)。

趙瑞，1986年生，女，博士，研究實習員，主要從事藥物分析和臨床檢驗的研究。

劉麗宏，主任藥師，博士，E-mail：hongllh@126.com。

R446.11

A

2016-10-02)