不同劑量ALA-PDT對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖的抑制作用

張 鑫 郝玉琴

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·論著·

不同劑量ALA-PDT對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖的抑制作用

張 鑫1,2郝玉琴1

目的： 確定5-氨基酮戊酸-光動(dòng)力療法對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞抑制的最佳劑量。方法： 體外培養(yǎng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株，應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同ALA濃度(0.5、1、2 mmol/L)、不同PDT光照劑量(5、10、20、40 J/cm2)下A431細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果： 當(dāng)ALA濃度為0.5 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為6%、10%、15%、18%；當(dāng)ALA濃度為1 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為30%、52%、80%、82%；當(dāng)ALA濃度為2 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為31%、54%、81%、82%。結(jié)論： ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為20 J/cm2時(shí)，ALA-PDT對(duì)A431細(xì)胞增殖抑制效果達(dá)到最佳。

ALA-PDT； 皮膚鱗狀細(xì)胞癌； A431細(xì)胞； 增殖

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是皮膚癌中常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高。SCC的治療方法很多，ALA-PDT是繼手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)療法后,近二十年發(fā)展起來(lái)的新療法,由光敏劑受光活化形成活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡,是一種基于光敏劑光毒性反應(yīng)的新的治療方法[1]。ALA-PDT在臨床治療腫瘤中已取得了令人矚目的成就，ALA-PDT最突出的優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確定位靶組織，可選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而對(duì)鄰近的正常組織影響較小。與手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療手段相比，PDT創(chuàng)傷小、毒性低，兼具美容效果[2,3]，在腫瘤治療中具有不可替代的優(yōu)點(diǎn)。盡管ALA-PDT已在臨床使用，但關(guān)于其基礎(chǔ)研究，各學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究的作用劑量有很大出入。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度ALA、光照劑量來(lái)觀察ALA-PDT對(duì)鱗癌A431細(xì)胞的作用效果，旨在為ALA-PDT用于細(xì)胞等基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：ALA為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；96孔反應(yīng)板為德國(guó)Roche公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為T(mén)hermo Labsystems公司產(chǎn)品；紅光光照儀為普門(mén)公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人A431皮膚鱗癌細(xì)胞株(由長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司提供)貼壁培養(yǎng)于DMEM(高糖型)完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，置37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2 d換液一次，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，待長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個(gè)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組:無(wú)光敏劑未光照組;光照對(duì)照組：僅照光無(wú)光敏劑;藥物對(duì)照組：僅加藥未光照; ALA-PDT組:不同ALA濃度+不同光照劑量。

1.4 細(xì)胞PDT處理 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A431細(xì)胞以每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)基體積200 μL。待A431細(xì)胞貼壁24 h后，進(jìn)行上述干預(yù)。ALA的濃度分別為:0、0.5、1、2 mmol/L；ALA避光孵育時(shí)間:4 h；光照劑量:紅光儀，波長(zhǎng)635 nm，功率密度為18 mW/cm2，光斑距96孔板5 cm處垂直照射，治療光斑完全覆蓋實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，光照能量密度分別為：5、10、20、40 J/cm2。藥物對(duì)照組：ALA 1 mmol/L,嚴(yán)格避光。干預(yù)后立即更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。每組平行3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖活力 各組細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，避免吸去紫色結(jié)晶。

每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。

選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值OD，記錄結(jié)果，以未加藥細(xì)胞組作為空白對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率/存活率，抑制率(IP)=(1-藥物組OD/對(duì)照組OD)×100%；存活率=藥物組OD/對(duì)照組OD×100%。對(duì)照組存活率為100%，

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)照光及單獨(dú)加藥對(duì)細(xì)胞并無(wú)增殖抑制作用。

2.2 不同濃度ALA和不同光照劑量對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制率影響 見(jiàn)表1，圖1。當(dāng)ALA濃度為0.5 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為6%、10%、15%、18%；當(dāng)ALA濃度為1 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為30%、52%、80%、82%；當(dāng)ALA濃度為2 mmol/L時(shí)，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2，對(duì)A431細(xì)胞的抑制率分別為31%、54%、81%、82%。

表1 不同濃度ALA和不同光照劑量對(duì)A431細(xì)胞抑制率影響

注：*與對(duì)照組比較P<0.05

圖1 不同濃度ALA和不同光照劑量對(duì)A431細(xì)胞抑制率影響

2.3 當(dāng)ALA濃度為1 mmol/L與2 mmol/L對(duì)A431細(xì)胞抑制作用效果明顯，二者間的作用效果差異不大；A431細(xì)胞抑制率隨光照劑量的增加而增加，在20～40 J/cm2內(nèi)增加不明顯。

3 討論

SCC是皮膚科常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐漸增高。目前的治療方法包括手術(shù)切除(Mohs手術(shù))、冷凍療法 、電灼燒、局部治療(5-氟脲嘧啶和咪喹莫特)、放射治療等。對(duì)于大面積、特殊部位(面部、外生殖器)以及多灶性病變的SCC，這些方法療效不佳，而且容易形成疤痕。此外，這些療法所具有的美容效果非常有限，難以滿足人們對(duì)良好外觀的要求。PDT是近20年來(lái)興起并不斷發(fā)展的一項(xiàng)腫瘤治療新技術(shù)，在臨床治療腫瘤中已取得了令人矚目的成就，由于皮膚病損組織的照光容易實(shí)現(xiàn)，PDT在皮膚科的應(yīng)用是比較活躍的研究課題[4-6]。PDT作為一種新療法，具有良好的組織選擇性，不破壞正常細(xì)胞且不受皮損位置及大小的限制，成為目前臨床治療SCC等增殖性疾病使用越來(lái)越多的手段。

ALA-PDT雖然已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但有關(guān)其基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)作用劑量各研究者有很大出入，如喬麗等[7]關(guān)于ALA-PDT對(duì)皮膚鱗癌A431的增殖研究時(shí)采用的ALA為0.4 mg/mL,功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2。劉園園等[8]研究發(fā)現(xiàn)ALA濃度為3.2 mmol/L、光照劑量為80 J/cm2時(shí)，ALA-PDT對(duì)皮膚鱗癌A431細(xì)胞的抑制作用達(dá)最佳。張秀娟等[9]研究ALA-PDT對(duì)人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的殺傷作用是采用ALA濃度為40 μg/mL，功率密度230 mW/cm2。其中能量密度、功率密度、照光時(shí)間是照光的三大參數(shù)，三者之間的換算公式：照光時(shí)間(S)=能量密度(J/cm2)/功率密度(W/cm2)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度ALA、光照劑量來(lái)觀察ALA-PDT對(duì)鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的抑制作用，旨在為ALA-PDT用于細(xì)胞等基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)劑量依據(jù)。為明確ALA-PDT對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖抑制的最佳作用劑量，我們釆用MTT法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用藥和單獨(dú)照光對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)基本無(wú)影響。在相同的培養(yǎng)時(shí)間和ALA濃度下，隨著光照劑量遞增細(xì)胞抑制率呈上升趨勢(shì)，但在20～40 J/cm2這兩個(gè)光照劑量之間，細(xì)胞抑制率上升不明顯，各ALA濃度組在20～40 J/cm2這兩個(gè)光照劑量之間，細(xì)胞抑制率差異無(wú)顯著性(均P>0.05)，殺傷作用進(jìn)入平臺(tái)期。提示并非光照劑量越高對(duì)細(xì)胞殺傷越強(qiáng)。同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間和光照劑量相同時(shí)，ALA濃度為1 mmol/L、2 mmol/L與ALA濃度為0.5 mmol/L相比，不同光照劑量對(duì)A431細(xì)胞抑制率差異有顯著性(均P<0.05)，而ALA濃度為1 mmol/L與2 mmol/L時(shí)，不同光照劑量對(duì)A431細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異無(wú)顯著性(均P>0.05)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，對(duì)于體外培養(yǎng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞，ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為10 J/cm2時(shí)，A431細(xì)胞抑制率為52%；ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為20 J/cm2時(shí)，A431細(xì)胞抑制率為82%，ALA-PDT的殺傷作用最佳。

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(收稿：2016-09-05 修回：2016-10-28)

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Inhibition of ALA-PDT on A431 cells in cutaneous squamous cell carcinoma

ZHANGXin1,2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,theThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.GraduateStudentinInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohehot010010,ChinaCorrespondingauthor:HAOYuqin,E-mail:haoyuqin0472@163.com

Objective: To determine the optimal dose of ALA-PDT on the inhibition of A431 cells proliferation in cutaneous squamous cell carcinoma. Methods: A431 cells were cultured firstlyinvitro, and then, were treated with different drug concentration (0.5, 1 and 2 mmol/L) and different dose of PDT (5, 10, 20 and 40 J/cm2). The proliferation of treated A431 cells was detected by MTT. Results: The inhibition rates of A431 cells treated under the condition of 0.5 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 6%, 10%, 15% and 18% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 1 mmol/L ALA combined with PDT of 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 30%, 52%, 80% and 82% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 2 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 31%, 54%, 81% and 82% respectively. Conclusion: The highest inhibition rate of PDT on A431 cell proliferation is 1mmol/L ALA and 20 J/cm2PDT.

ALA-PDT; cutaneous squamous cell carcinoma; A431 cell; proliferation

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014MS0895)

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院)皮膚科，包頭市，014010

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail: haoyuqin0472@163.com